新基因mgt-16反转录病毒载体的构建及其在小鼠间充质干细胞中的表达

• 作者: 姜帆 孙慧勤 王明科 程晋 粟永萍 邹仲敏
• 来源期刊: 第二军医大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: mgt-16 过表达 反转录病毒 间质干细胞
• 年，卷（期）: 2014,（4）
• 所属期刊栏目: 短篇论著
• 页码范围: 447-451
• 分类号: R349.83
• 语种: 中文
• DOI: 10.3724/SP.J.1008.2014.00447

摘要

目的 构建表达小鼠新基因mgt-16的反转录病毒载体,并观察其在小鼠胚胎间充质干细胞C3H/10T1/2(简称10T1/2细胞)中的表达.方法 以含小鼠新基因mgt-16的DNA序列为模板PCR扩增得到mgt-16编码序列,T-A克隆后测序获得pMD18T-16质粒,与真核表达载体pEGFP-N1酶切、连接、转化,通过PCR、酶切鉴定和测序获得正确的pEGFP-N1-16载体.将pEGFP-N1-16载体中含mgt-16的片段克隆至反转录病毒载体pLEGFP-N1,通过酶切鉴定和测序获得正确的pLEGFP-N 1-16反转录病毒载体.将pLEGFP-N1-16转染反转录病毒包装细胞Phoenix,制备携带mgt-16与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)的反转录病毒,感染小鼠间充质干细胞10T1/2后,400 μg/mL G418筛选获得稳定表达mgt-16与EGFP融合蛋白的10T1/2细胞克隆.荧光显微镜观察MGT-16蛋白的表达及亚细胞定位.结果 PCR扩增得到大小约300 bp的mgt-16条带,T-A克隆后测序显示获得的mgt-16序列与Genbank数据库序列相同.构建的pEGFP-N1-16载体经PCR、酶切鉴定和测序验证构建成功,构建的反转录病毒载体pLEGFP-N1-16经酶切鉴定和测序验证构建成功.荧光显微镜观察MGT-16主要在Phoenix细胞和小鼠间充质干细胞的细胞质表达,核周表达水平较高.结论 成功构建了小鼠新基因mgt-16的反转录病毒载体,并在间充质干细胞中表达,为进一步研究新基因mgt-16在间充质干细胞中的功能奠定了基础.