家蚕卵黄原蛋白受体BmVgR的体外表达

• 作者: 刘红玲 夏庆友 张海燕 彭芷昕 杨从文 林英 沈关望 罗娟 邢润苗 陈恩祥
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 家蚕 卵黄原蛋白受体 原核表达 细胞表达
• 年，卷（期）: 2014,（19）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 3922-3928
• 页数: 7页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.022

摘要

【目的】克隆家蚕卵黄原蛋白受体（vitellogenin receptor, VgR），分析其在昆虫细胞中的表达特征，了解正常VgR和突变VgR的表达模式，为阐明其生物学功能提供参考依据。【方法】基于家蚕VgR的基因编码序列设计特异引物，扩增的目的片段连接到载体pET28a上，构建原核表达载体，转化E. coilBL21（DE3）表达菌株， IPTG诱导获得目的蛋白；用镍柱亲和层析方法纯化诱导表达的家蚕VgR肽蛋白；将纯化后的肽蛋白制备BmVgR的兔源多克隆抗体；PCR扩增获得大造和突变型白妙卵（scantyvitellin，vit）的LBD1+EGF1结构域（C11D和C11V）片段，连接到细胞表达载体上，通过细胞转染表达目的蛋白，采用细胞免疫组化检测大造和突变型vit的VgR在细胞里的表达情况；通过Western blot检测细胞培养液中大造和突变型vit VgR的表达量。【结果】原核表达获得了一个大小约为22 kD的融合蛋白，以包涵体形式表达；镍柱亲和层析初纯化得到BmVgR的肽蛋白，进一步切胶纯化后，以此为抗原制备 BmVgR 的兔源多克隆抗体，其抗体效价＞1﹕512000，纯度为95%以上。转录水平检测表明Sf9和Spli221昆虫细胞中没有BmVgR和BmVg内源基因的表达；在Sf9昆虫细胞中成功表达了家蚕野生型和突变型vit BmVgR的结构域SP+LBD1+EGF1肽段，家蚕突变型vit在BmVgR第1个表皮生长因子同源区域的第3个ClassB区域有编码50个氨基酸残基的核酸序列缺失；细胞免疫组化试验表明，突变型和正常型的C11V和C11D都能在Sf9细胞质中正常表达；制备的BmVgR兔源多克隆抗体和Myc标签抗体同时检测到细胞表达的目的蛋白，表明试验所制备的VgR抗体特异性较好；由于SP+LBD1+EGF1肽段存在信号肽，细胞表达的蛋白会分泌进入细胞培养液中，Western blot对培养液进行蛋白检测，表明突变型vit存在氨基酸缺失，但并不影响肽蛋白的正常表达，且表达量没有明显差异。【结论】EGF1结构域的缺失并不影响SP+LBD1+EGF1肽蛋白的正常表达，可能是其蛋白功能异常导致突变型vit表型产生。