林烟草KUP/HAK/KT钾转运体基因NsHAK11的亚细胞定位与表达

• 作者: 冯祥国 刘好宝 刘朝科 史素娟 宋毓峰 张良 王倩 胡晓明 董连红 靳义荣
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 林烟草 生物信息学 KUP/HAK/KT家族 NsHAK11 亚细胞定位 基因表达模式
• 年，卷（期）: 2014,（6）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种?种质资源?分子遗传学
• 页码范围: 1058-1071
• 页数: 14页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.06.003

摘要

【目的】应用生物信息学方法，分离和克隆烟草钾转运体KUP/HAK/KT家族新基因，对其进行亚细胞定位和表达分析，为开展烟草 KUP/HAK/KT 钾转运体的研究提供借鉴。【方法】通过生物信息学方法，搜索林烟草（Nicotiana sylvestris）和绒毛状烟草（N.tomentosiformis）基因组数据库，预测两种烟草中的钾转运体KUP/HAK/KT 家族成员，构建系统进化树。根据所获结果，从林烟草中获得一个新的烟草KUP/HAK/KT家族基因。采用Wolf PSORT对蛋白的亚细胞定位进行预测，并利用农杆菌浸润法注射本生烟（N.benthamiana）叶片后激光共聚焦显微镜下观察，依据融合荧光蛋白在细胞内产生荧光的位置确定蛋白的亚细胞定位，用以验证预测结果；采用PLACE网站对基因的表达模式进行预测，并用荧光定量PCR分别研究其在盛花期林烟草不同器官的表达差异及低温、高温和低钾胁迫下苗期林烟草叶片中NsHAK11的表达变化，用以验证预测结果。【结果】预测出林烟草和绒毛状烟草KUP/HAK/KT钾转运体家族均含有19个成员，进化上分为4个Cluster（簇）。根据预测序列结果，从林烟草中克隆得到一个ClusterⅢ中的基因，其编码蛋白与拟南芥（Arabidopsis thaliana）中AtKUP11的相似性最高，因此，将其命名为NsHAK11，其编码蛋白与已获得的2个烟草NrHAK1和NtHAK1的相似性仅为48%和49%，所以NsHAK11是一个新的烟草KUP/HAK/KT基因。Wolf PSORT预测显示NsHAK11主要定位于细胞质膜中。亚细胞定位试验中NsHAK11与GFP和DsRed2两种报告蛋白融合的定位结果均表明NsHAK11定位于细胞质膜中，与预测结果相符。利用PLACE网站对NsHAK11启动子分析得到，NsHAK11可表达与定位于根、花和胚芽组织中，受到低温、高温、干旱和激素等因素的影响。实时荧光定量PCR分析结果与预测结果基本一致：NsHAK11在盛花期林烟草各组织器官中均有表达，但表达水平存在强弱差异，其在主根中的表达量最高，在侧根中的表达量次之，而在叶片中的表达量最低；NsHAK11在苗期林烟草叶片中受低温、高温和低钾胁迫时呈现不同类型的上调表达，其中，低温处理时NsHAK11的表达上调程度最大且响应时间最早，高温处理时其表达上调程度次之，但在前期会出现明显抑制，低钾处理时其表达量可上调表达，但并不显著。【结论】获得了一个烟草KUP/HAK/KT基因家族新成员NsHAK11，其编码蛋白为主要定位于细胞质膜中的钾转运体，该蛋白广泛存在于各组织器官中，参与叶片响应低温、高温和低钾胁迫的应对机制。