瘤胃细菌群落多样性研究中变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法的优化

• 作者: 卜登攀 张俊 杜洪 王加启 赵圣国 金迪
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 关键词: 瘤胃 细菌群落 变性梯度凝胶电泳(DGGE) 单链DNA(ssDNA)
• 年，卷（期）: 2015,（6）
• 所属期刊栏目: 研究资源与技术改进
• 页码范围: 831-840
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2015.06.016

摘要

为了提高瘤胃细菌多样性研究中变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)方法的准确性,本研究对DGGE的最佳变性剂梯度范围、PCR扩增程序和PCR产物处理方法进行了优化.设计DGGE变性剂浓度梯度为35％～70％、40％～60％和55％～65％,分别利用一步PCR和修补PCR(reconditioning PCR)对瘤胃细菌16S rDNA进行扩增;PCR产物分别经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(denatured polyacrylamide gel electrophoresis,d-PAGE)和绿豆核酸酶纯化;之后对DGGE凝胶图谱聚类分析,并选取部分DGGE条带割胶测序.结果表明,DGGE的变性剂浓度为40％～60％时,DGGE图谱中条带分离效果较好.修补PCR结合d-PAGE纯化在一定程度上可减少PCR产物中的单链DNA(single-stranded DNA,ssDNA).通过聚类和条带割胶测序分析发现,不同处理方法条件下DGGE图谱条带分布不同,DGGE凝胶图谱中的单一条带并不能代表是单一菌种.本研究在用DGGE对瘤胃细菌群落多样性分析时使用40％～60％凝胶变性剂浓度,并用修补PCR结合d-PAGE纯化样品DNA可获得最佳效果.研究结果为瘤胃微生物样品DGGE分析提供了参考资料.