H9N2亚型AIV鼠肺适应株的获得及其氨基酸变异分析

• 作者: 丁洁 于志君 华育平 夏咸柱 张坤 柴洪亮 桑晓宇 王铁成 程凯慧 高玉伟
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 禽流感 H9N2 小鼠 致病力
• 年，卷（期）: 2015,（15）
• 所属期刊栏目: 专题:流感病毒对人类和畜牧业健康的影响
• 页码范围: 3056-3063
• 页数: 8页
• 语种: 中文

摘要

【目的】将H9N2亚型禽流感病毒在豚鼠体内连续性传播9代后，能够稳定的在豚鼠间传播，可见H9N2亚型禽流感病毒对哺乳动物的感染能力以及在哺乳动物间传播的能力还是很强的。因此，使用此株病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010(H9N2)简称JN，应用小鼠动物模型，研究H9N2亚型流感病毒在小鼠肺内适应性传代后对小鼠的致病力，以及传代过程中流感病毒的变异。检测和筛选流感病毒致病性变异的关键氨基酸位点，探索H9N2亚型流感病毒变异的分子机制。【方法】将一株H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Jinan/Li-2/2010（H9N2）在小鼠的肺脏进行传代，将小鼠解剖、摘除肺部、研磨离心后经滴鼻接种下一代小鼠，传播九代后，用MDCK细胞扩繁病毒，得到鼠肺适应株JN-P9-2-M1；扩增、克隆传代病毒JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1的全基因测序，推断各基因编码的氨基酸，与JN原代病毒(P0)的核苷酸和氨基酸相比对，得到各代次病毒核苷酸与氨基酸变化的位点；解剖小鼠，获得小鼠的肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、脑和肠，滴定各组织中的病毒滴度，检测病毒的组织噬性；乙醚麻醉小鼠后，每个病毒稀释度鼻内接种3只小鼠，检测小鼠的幸存率和发病率；采集攻毒小鼠的肺部，固定后进行病理切片和免疫组化，比较JN原代病毒与JN-P9-2-M1对小鼠肺部的损害。【结果】JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高，其MLD50为103.5EID50，106EID50、105EID50、104EID50攻毒剂量的小鼠幸存率是0，而原毒JN对小鼠不致死，JN-P9-2-M1对小鼠的致病性比原毒提高了至少1000倍；攻入JN-P9-2-M1病毒剂量为106—103EID50的小鼠，体重明显减少，临床症状也很明显，攻毒后3—8 d，小鼠表现精神萎靡、被毛零乱、呼吸急促、弓背等症状，而原毒JN在106EID50时，小鼠的体重变化率都跟阴性对照组相似；JN-P5-2-M1和JN-P9-2-M1同原毒JN的受体结合特性相同，都是只能特异性结合 SAa-2,6Gal 受体，具有人样流感病毒的受体结合特性；JN 病毒仅能在小鼠肺部检测到，病毒滴度很高，而JN-P9-2-M1不仅在小鼠肺部有很高的滴度，在小鼠的肝脏、脾脏、肾脏和脑部都能检测到。【结论】 JN-P9-2-M1对小鼠的致病性明显提高，比原毒提高了至少1000倍；PB2 E627K、HA N313D和HA N496S等3个位点可能是病毒对小鼠致病力初步提高的原因，而PA L342I和NA N218T这两个点突变，就有可能是进一步提高病毒对小鼠致病力的关键位点。