棉花GhGT-2转录因子的克隆及其功能分析

• 作者: 刘晓东 李月 武冬梅 董永梅 谢宗铭 陈受宜
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 棉花 Trihelix转录因子 非生物胁迫 亚细胞定位 转录激活 凝胶迁移试验
• 年，卷（期）: 2015,（24）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种?种质资源?分子遗传学
• 页码范围: 4872-4884
• 页数: 13页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.24.002

摘要

【目的】棉花是重要的纤维作物，其生长常遭受非生物逆境危害，严重影响棉花的生长和产量。Trihelix转录因子在植物抵御各种逆境胁迫中扮演重要作用。克隆棉花Trihelix转录因子基因并分析其表达特性和功能，为最终利用转基因手段改良棉花抗逆性奠定基础。【方法】通过BLAST分析比对，从棉花EST数据库中获得1个高度同源基因，通过基因序列分析，发现其属于Trihelix转录因子GT-2亚家族，命名为GhGT-2。以棉花叶片总RNA为模板，根据EST序列设计引物，利用RT-PCR结合RACE技术，获得GhGT-2的编码序列。使用MEGA5对蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析，并构建同源物种间系统进化树，通过 SMART 网站（http：//smart.embl- heidelberg.de/）进行蛋白结构预测。以陆地棉品种新陆早26号为研究材料，在棉花15 d苗龄时（一对真叶期），分别对其植株进行非生物胁迫和ABA处理0、1、3、6和12 h，然后采集相应时段棉苗叶片。另外采集同一品种棉花的不同发育时期的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 days post anthesis，DPA）纤维等不同组织样品，利用实时荧光定量PCR方法分析GhGT-2在棉花不同组织间的表达差异及其在低温、干旱、高盐和ABA处理下的表达模式。将GhGT-2克隆至GFP表达载体pBI221，和GAL4 DNA结合结构域载体，在拟南芥原生质体中验证GhGT-2在细胞内的定位情况和转录激活活性。利用凝胶迁移试验（EMSA）检测DNA结合元件。【结果】克隆了棉花GhGT-2的cDNA全长序列。该基因cDNA全长1579 bp，开放阅读框为1428 bp，编码475个氨基酸的蛋白，推导编码蛋白质的分子量为54.07 kD，等电点为8.96。SMART蛋白结构预测发现，该蛋白含有2个Trihelix家族典型的SANT蛋白结合域。系统进化树分析表明，GhGT-2属于Trihelix转录因子GT-2亚家族，与拟南芥AtGTL1、白杨PtaGTL1亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明，GhGT-2在棉花的根、茎、叶、花、开花后当天胚珠以及开花后12 d（12 DPA）纤维中均有表达，其中，在叶中表达量最高，在根中表达量最低。在冷胁迫下， GhGT-2除在3 h时表达量接近0 h外，在1、6和12 h的表达量均低于0 h，呈现抑制表达特征。在高盐、干旱和ABA处理3种胁迫下，GhGT-2在1 h的表达量均低于0 h，但3、6和12 h的表达量均高于0 h，表现为先抑制后上调表达特征。推测该基因可能参与棉花ABA信号通路中对逆境胁迫的抗性反应。利用拟南芥原生质体分析，GhGT-2主要定位于细胞核中，转录激活活性不明显。凝胶阻滞（EMSA）分析发现，GhGT-2可以结合GT 元件 GT2-Box、GT3-Box、GT-1b（BoxⅡ）和 MYB 元件 MBS1、MRE1、MRE3、MRE4。【结论】获得棉花GhGT-2的全长cDNA序列，其编码蛋白含有2个SANT蛋白结合域，属于棉花Trihelix转录因子GT-2亚家族。在干旱、高盐和ABA逆境胁迫下，GhGT-2属于依赖于ABA胁迫响应基因调控网络，推测GhGT-2在陆地棉的非生物胁迫适应过程中可能具有重要的作用。