家蚕组织蛋白酶O（BmCatO）基因鉴定及表达分析

• 作者: 余霜 崔红娟 张奎 晁会娟 李钰添 梁航华 苏晶晶 赵羽卒 陈思源
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 家蚕 蛋白酶O基因 克隆 时空表达 抗体制备
• 年，卷（期）: 2015,（22）
• 所属期刊栏目: 畜牧?兽医?资源昆虫
• 页码范围: 4564-4573
• 页数: 10页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.22.016

摘要

【目的】克隆家蚕（Bombyx mori）蛋白酶O基因Cathepsin O（BmCatO），分析其mRNA表达特征，通过原核表达、蛋白纯化和多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体，为进一步探究组织蛋白酶O在家蚕变态发育中的功能奠定基础。【方法】利用RACE技术克隆获得家蚕组织蛋白酶O的全长cDNA序列,然后采用RT-PCR对其时空表达特征进行研究。从NCBI下载其他物种组织蛋白酶O基因序列，利用Clustalx和MEGA 6.0软件进行同源比对和进化分析。选取特异性较高的片段设计特异性引物，将PCR扩增产物连接至PET32a质粒，转化至E. coil表达菌株Rosetta(DE3)，经IPTG诱导获得组织蛋白酶O重组蛋白，然后利用Ni+亲和层析方法对重组蛋白进行纯化，最后多次免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。【结果】家蚕组织蛋白酶O基因存在于家蚕第14号染色体上，scaffold为nscaf2943，基因编号BGIBMGA009231。该基因有两种剪切形式，剪切体1开放阅读框（ORF）全长为1071 bp，编码356个氨基酸，预测蛋白分子量36 kD,等电点8.594；剪切体2 ORF全长为942 bp，编码313个氨基酸，预测蛋白分子量40 kD，等电点7.951。两种剪切体均有6个外显子和5个内含子构成，剪切体2的第六外显子出现部分缺失。两种剪切体编码的蛋白结构相似，均含有信号肽、Inhibitor129和Pept-C1结构域。进化分析结果表明，无脊椎动物组织蛋白酶单独聚为一类，且家蚕组织蛋白酶O与同为鳞翅目成员的二化螟（Chilo suppressalis）组织蛋白酶O最为接近。RT-PCR结果显示该基因特异性持续表达于幼虫血细胞，剪切体1的表达水平明显高于剪切体2，但这两种剪切体在幼虫血细胞发育时期表达趋势一致。构建家蚕组织蛋白酶 O 原核表达系统，利用亲和层析纯化获得高纯度的家蚕组织蛋白酶 O 重组蛋白，并利用纯蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体，ELISA 显示其效价高达到1﹕1280000。Western印迹结果表明，该抗血清可以特异性识别家蚕组织蛋白酶O重组蛋白。【结论】获得了家蚕组织蛋白酶O基因的完整cDNA序列及表达特征，经原核表达、纯化获得高纯度的融合蛋白，通过多次免疫新西兰大白兔成功获得抗体。