IKK2EE重组慢病毒载体的构建及其在NF-κB信号通路中的功能验证

• 作者: 卢春 秦娣 胡敏敏 薛雪
• 来源期刊: 江苏大学学报（医学版）
• 学科: 医学
• 关键词: 核转录因子κB IKKβ 转染 慢病毒
• 年，卷（期）: 2016,（1）
• 所属期刊栏目: 基础医学
• 页码范围: 11-16
• 页数: 6页
• 分类号: R393
• 字数: 3980字
• 语种: 中文
• DOI: 10.13312/j.issn.1671-7783.y150259

摘要

目的:构建含IKK2EE的重组慢病毒载体,并检测其对核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的影响.方法:以真核表达质粒pMIGR1-IKK2EE为模板扩增出KK2EE基因片段,并将其插入至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP中,构建重组质粒pCDH-IKK2EE.将此重组质粒和NF-κB虫荧光素酶报告质粒共同转染人胚肾上皮细胞(293 T细胞),24 h后检测IKK2EE对NF-κB活性的影响.将重组质粒pCDH-IKK2EE与包装质粒ps-PAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293 T细胞,包装表达IKK2EE的重组慢病毒,采用病毒梯度稀释法测定病毒滴度.将重组慢病毒感染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),通过免疫印迹法检测IKK2EE以及NF-κB信号通路中相关蛋白的表达,进一步采用免疫荧光法检测NF-κB p65亚基的核定位.结果:质粒双酶切鉴定以及核酸测序比对结果证实重组质粒pCDH-IKK2EE构建成功.虫荧光素酶报告实验结果显示,IKK2EE能够显著增强NF-κB报告质粒的活性.病毒梯度稀释法测得重组慢病毒滴度约为2×107pfu/mL.重组慢病毒感染HUVECs后,蛋白质印迹结果显示,细胞中磷酸化的NF-κB抑制子(inhibitor of NF-κB,IκB)激酶β(IKKβ)表达升高,IκBα表达下降以及磷酸化的p65表达上升.免疫荧光检测结果表明,重组慢病毒介导的IKK2EE能够显著促进HU-VECs中NF-κB p65亚基入核.结论:成功构建了含IKK2EE的重组慢病毒载体,且其能够增强NF-κB信号通路活性.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	卢春	南京医科大学病原生物学系	92	236	7.0	9.0
2	薛雪	南京医科大学病原生物学系	5	19	3.0	4.0
3	胡敏敏	南京医科大学病原生物学系	6	23	2.0	4.0
4	秦娣	南京医科大学病原生物学系	22	40	4.0	4.0