大鼠核因子-κB反义RNA腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

• 作者: 吴可贵 胡榕 许昌声
• 来源期刊: 中国临床药理学与治疗学
• 关键词: 核因子-κB 反义RNA 腺病毒载体 表达调控 蛋白免疫印迹 大鼠
• 年，卷（期）: 2005,（4）
• 所属期刊栏目: 研究原著
• 页码范围: 391-396
• 页数: 6页
• 分类号: R966
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1009-2501.2005.04.007

摘要

目的:构建表达大鼠核因子κB(NF-κB, p65)反义RNA的重组腺病毒,并测定受染血管平滑肌细胞(VSMCs)中NF-κB基因的表达变化.方法:从自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)的VSMCs中提取总RNA,经RT-PCR方法获得含全部编码序列的NF-κB (p65)cDNA片段(1 653 bp),用TA克隆技术插入pMD18-T载体,构建pMD18-T/1653重组质粒,并经酶切和DNA测序鉴定.以该质粒为模板,经PCR获得NF-κB(p65)3'端 269 bp 片段,逆向插入pcDNA3.1(+)真核表达载体并置于CMV启动子下.由此构建的pcDNA3.1(+)/269质粒含有NF-κB(p65)的269 bp反义RNA完整表达框.随后将该表达框克隆到入门载体pENTR4,构建重组质粒pENTR4/CMV/269.使用同源重组方式在体外将该表达框重组到腺病毒载体pAd/PL-DEST,最终得到重组腺病毒质粒pAd/CMV/269.线性化的重组腺病毒质粒转染293细胞后产生的重组腺病毒颗粒用于VSMCs的感染.Western Blot测定感染前后VSMCs中NF-κB(p65)表达的变化情况.结果:构建的pMD18-T/1653重组质粒经过序列测定,证实其包含大鼠NF-κB(p65)基因的1653 bp片断;pcDNA3.1(+)/269、pENTR4/CMV/269、pAd/CMV/269等重组质粒经内切酶消化或PCR等方法鉴定无误;线性化的pAd/CMV/269转染293细胞后,可产生完整、具有感染性的重组腺病毒颗粒,病毒在感染上清中的滴度为 9.23×109 pfu·ml-1(plaque form units per milliliter);Western Blot检测证实,感染重组腺病毒的VSMCs中的NF-κB(p65)蛋白水平明显减少.结论:构建了可表达大鼠NF-κB (p65)反义RNA的重组腺病毒Ad/CMV/269,该病毒在受染的VSMCs内具有下调NF-κB (p65)基因表达的生物学功能,为后续的基因治疗研究奠定基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	吴可贵		26	178	8.0	12.0
2	胡榕	福建医科大学附属协和医院心内科	13	56	3.0	7.0
4	许昌声		26	91	6.0	7.0