柔嫩艾美耳球虫胱硫醚β合成酶基因克隆及在真核细胞中的表达

• 作者: 夏伟丽 朱雪龙 朱顺海 李聪 王自文 董辉 赵其平 门启斐 黄兵
• 来源期刊: 中国动物传染病学报
• 学科: 农学
• 关键词: 柔嫩艾美耳球虫 胱硫醚β合成酶 DF-1细胞 真核表达
• 年，卷（期）: 2016,（2）
• 页码范围: 53-61
• 页数: 9页
• 分类号: S852.723
• 字数: 7495字
• 语种: 中文

摘要

为构建柔嫩艾美耳球虫胱硫醚β合成酶(Eimeria tenella cystathionine β-synthase,EtCBS)基因的真核重组表达质粒pBiFC-VC155-Et CBS,利用RACE技术克隆了Et CBS基因的全长cDNA序列,对其编码的蛋白进行相关生物信息学分析.通过RT-PCR扩增含完整开放阅读框(open reading frame,ORF)的cDNA片段,将其与真核表达载体pBiFC-VC155连接,经PCR、双酶切和测序鉴定正确后,转染DF-1细胞,用免疫印迹和间接免疫荧光技术鉴定重组蛋白表达情况.结果显示,成功获得了Et CBS基因的全长cDNA序列,该基因全长2423 bp,ORF位于第201~2087bp之间,编码629个氨基酸,编码蛋白的分子量约为68kDa.生物信息学分析发现该基因编码的蛋白不具有信号肽,也不存在跨膜结构.Western blot可见大小约为68kDa的重组表达蛋白条带,间接免疫荧光实验显示在转染的DF-1细胞中能检测到绿色荧光.研究结果表明,本研究已成功获得了EtCBS基因的全长cDNA序列,成功构建了EtCBS基因含完整ORF的真核重组表达质粒,并在DF-1细胞中实现了表达,为深入研究EtCBS基因的功能奠定了基础.