小鼠肺部TMEM16A基因表达沉默模型的建立

• 作者: 张会然 李宏林 郭丽娜 阎锡新
• 来源期刊: 国际呼吸杂志
• 关键词: TMEM16A RNA干扰 慢病毒 LA795
• 年，卷（期）: 2016,（10）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 757-762
• 页数: 6页
• 字数: 3610字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-436X.2016.10.010

摘要

目的 构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体,通过气管内注射慢病毒载体,局部部分沉默小鼠肺部TMEM16A基因的表达,为后续在体研究TMEM16A在肺部作用提供基础.方法 ①构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体;②免疫荧光法验证LA795小鼠肺腺癌细胞膜上TMEM16A的表达,体外行慢病毒感染实验,确定感染的最佳条件,最后体外实验确定慢病毒的干扰效率;③链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶连接法(streptavidin-perosidase,SP)法验证肺组织中TMEM16A的表达;④气管内注射慢病毒2周后行支气管肺泡灌洗,BAC法检测灌洗液中蛋白及酶联免疫吸附法测定(ELISA)法检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactor-a,TNF-α)、IL-1β及IL-10的浓度;⑤气管内注射慢病毒2周后取材肺组织提取蛋白用蛋白印迹法(Western blot)验证在体TMEM16A-shRNA慢病毒载体的沉默效率.结果 ①LA795细胞膜上存在TMEM16A的表达,LA795细胞在5 mg/L的Eni.S+ polybrene条件下容易被感染,病毒感染复数(MOI)为20;②Western blot进一步显示体外细胞慢病毒shRNA的沉降效率约81.35％(P＜0.05);③气管内注入Lenti-Neg-shRNA后BALF的蛋白含量无增加,细胞因子TNF-α、IL-1β及IL-10的浓度无明显变化(P＞0.05);光镜下肺组织结构正常,未造成病理损伤;④气管内注入Lenti-TMEM16A-shRNA后,Western-blot结果显示TMEM16A表达水平降低(P＜0.05),达到在肺部部分沉默TMEM16A的目的.结论 本研究成功构建小鼠TMEM16A-shRNA慢病毒载体,体内实验证实慢病毒气管内注射是比较安全,未增加肺组织的蛋白渗漏及病理损伤,并能有效转染气道及肺泡上皮细胞并在局部表达,成功沉默肺部TMEM16A的表达.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	阎锡新	河北医科大学第二医院呼吸一科	139	694	13.0	19.0
2	李宏林	河北医科大学第二医院呼吸一科	9	46	3.0	6.0
3	张会然	河北医科大学第二医院呼吸一科	15	62	5.0	7.0
4	郭丽娜	河北医科大学第二医院中心实验室	54	320	10.0	13.0