沉默TNFAIP8抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7的迁移功能

• 作者: 冯世明 刘广超 吴素霞 杨菲 柴立辉
• 来源期刊: 中华微生物学和免疫学杂志
• 关键词: shRNA TNFAIP8 巨噬细胞 迁移
• 年，卷（期）: 2016,（4）
• 所属期刊栏目: 基础免疫学
• 页码范围: 288-293
• 页数: 6页
• 字数: 4652字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-5101.2016.04.010

摘要

目的：构建肿瘤坏死因子α诱导蛋白8(tumor necrosis factor alpha-induced protein 8, TNFAIP8)shRNA慢病毒表达载体,通过沉默TNFAIP8基因在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达,探讨TNFAIP8基因沉默对巨噬细胞功能的影响。方法设计合成TNFAIP8的特异性shRNA序列,退火后连入pLKO.1-TRC载体构建TNFAIP8 shRNA慢病毒表达载体,双酶切和基因测序鉴定构建载体序列的正确性；转染293T细胞制备慢病毒颗粒,将慢病毒颗粒感染RAW264.7细胞,沉默TNFAIP8基因在该细胞中表达,荧光定量RT-PCR和Western blot检测TNFAIP8的基因及蛋白表达水平验证基因沉默效果。培养基因沉默的RAW264.7细胞和对照组细胞,平皿黏附试验及划痕愈合试验观察TNFAIP8沉默对 RAW264.7细胞黏附及迁移能力的影响。结果双酶切电泳结果表明,构建的shRNA慢病毒载体酶切片段相对分子质量大小正确,基因测序结果也表明插入序列正确。荧光定量RT-PCR和Western blot结果表明,基因沉默组细胞中TNFAIP8的基因及蛋白表达水平较对照组细胞均显著降低(P<0.05)。平皿黏附试验结果发现,在接种15 min、30 min和2 h后,沉默组细胞黏附到培养皿底面上的细胞数量显著少于对照组细胞(P<0.05)。培养12 h后,和对照组细胞相比,沉默TNFAIP8的RAW264.7细胞伪足数量较少,且突起不明显。划痕愈合试验结果表明,划痕24 h后,对照组细胞划痕面积明显缩小,划痕愈合率达到50%左右,而沉默组细胞划痕愈合率只有25%左右,显著低于对照组细胞(P<0.05)。结论成功构建了 TNFAIP8 shRNA 慢病毒表达载体,该载体对TNFAIP8基因的表达具有良好的沉默效果；沉默TNFAIP8在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达可以显著抑制巨噬细胞的黏附和迁移能力。