EV71-2A突变质粒的构建及体内外功能初探

• 作者: 原素梅 张煦 彭宜红 徐超 熊庆 王源 谢冰玉
• 来源期刊: 微生物学免疫学进展
• 学科: 医学
• 关键词: 肠道病毒71型 突变质粒 构建 序列分析 生物学效应
• 年，卷（期）: 2016,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 19-22
• 页数: 4页
• 分类号: R373
• 字数: 3129字
• 语种: 中文
• DOI: 10.13309/j.cnki.pmi.2016.03.004

摘要

目的：构建pcDNA3.1-EV71-2A的突变质粒(EV71-2Amut),并对其功能进行检测,为进一步研究肠道病毒71型(Enterovirus type 71,EV71)2A蛋白酶的活性位点及其生物学功能奠定实验基础。方法利用聚合酶链式反应(PCR)定点诱变技术,定点突变编码EV71-2A第21His、39Asp 和110Cys 氨基酸的位点,构建EV71-2Amut,并测序鉴定。将所构建突变质粒与巨细胞病毒( Cytomegalovirus,CMV)启动子介导的真核细胞荧光素酶报告基因( pRL-CMV)共转染人横纹肌肉瘤细胞( RD细胞),通过观察转染组的EV71-2Apro 和EV71-2Amut 对pRL-CMV荧光强度的影响,判断突变质粒的细胞内酶活性。将EV71-2Apro 或EV71-2Amut 质粒转染BALB/c小鼠股四头肌,用RT-PCR检测局部相应质粒的mRNA水平,并观察局部肌肉组织的病理变化。结果构建的突变质粒EV71-2Amut 经测序及比对,结果与预计突变位点一致；在细胞学水平检测到的pRL-CMV荧光强度,EV71-2Amut 组比EV71-2Apro 组显著增高( P<0.05)；小鼠股四头肌注射局部均检出 EV71-2Apro 和 EV71-2Amut 的 mRNA 表达,且与 EV71-2Apro 组相比,EV71-2Amut 注射组的肌肉组织的肌肉凝固性坏死、炎症反应病理损伤较轻。结论成功构建了突变的EV71-2Amut 质粒,为研究EV71-2A蛋白酶的生物学功能奠定了实验基础。