一种检测乙型肝炎病毒核心启动子区nt1758-1777缺失突变新方法的建立

• 作者: 刘妍 廖昊 徐东平 李晓东 秦雅群 粘学渊 许智慧 陈建宏
• 来源期刊: 解放军医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 乙型肝炎病毒 核心启动子 基因缺失 熔解曲线 焦磷酸测序
• 年，卷（期）: 2016,（3）
• 所属期刊栏目: 基础研究
• 页码范围: 189-194
• 分类号: R512.62
• 语种: 中文
• DOI: 10.11855/j.issn.0577-7402.2016.03.04

摘要

目的 建立一种新的单管巢式实时荧光PCR熔解曲线法用于快速灵敏地筛检临床乙型肝炎病毒(HBV)样本核心启动子区nt1758-1777片段缺失突变.方法 通过比对分析GenBank收录的HBV基因序列,设计通用巢式PCR引物,建立优化方法体系;对340例慢性乙型肝炎患者血清HBV CP区进行扩增,产物直接测序,并随机选择50例样本进行克隆测序,分析nt1758-1777缺失突变检出率.野生型和缺失型标准质粒来自于单克隆测序样本,并对两种标准质粒及克隆检测样本进行荧光定量PCR扩增,获得熔解曲线及熔解温度,得到熔解曲线的阳性标准.用新建立的方法对340份样本进行检测,并用焦磷酸测序加以验证.结果 直接测序法检出16例(4.7％)阳性样本.标准质粒及克隆检测样本中缺失序列比例≥15％的样品,其熔解温度(Tm)≥88.3℃,遂将≥88.3℃作为新方法的阳性标准.用新方法检出47例(13.8％)阳性样本,其中用焦磷酸测序验证缺失突变比例≥1.0％的样本38例,＜1.0％的样本9例;15份阴性样本缺失突变比例均＜1.0％.用焦磷酸测序验证缺失突变比例1.0％作为阳性阈值,新方法对nt1758-1777缺失检测的阳性符合率为80.9％,阴性符合率为100％,两种方法的一致性Kappa值为0.671.结论 与直接测序法相比,新方法可显著提高nt1758-1777缺失检出率,结合焦磷酸测序证实,可有效提高检测的准确性和经济性.该方法对建立,BV其他缺失突变的检测方法也可提供借鉴.