玉米象线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因克隆与表达分析

• 作者: 侯昌亮 冯俊涛 吴华 张兴 李永强 王靖博 马志卿
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 玉米象 细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ RACE技术 生物信息学 原核表达
• 年，卷（期）: 2016,（23）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 4544-4554
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.23.007

摘要

[目的]克隆辣根素可能的作用位点——细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ (COX Ⅲ)的全长cDNA,并对其进行序列分析及原核表达.[方法]在NCBI数据库中查找玉米象(Sitophilus zeamais)COX Ⅲ已知的部分序列,利用RT-PCR,结合RACE技术克隆获得玉米象COXⅢ全长序列;利用DNAMAN8.0、MEGA5.1、GENEDOC、ProtParam和TargetP 1.1 Server等软件对该基因全长cDNA序列、系统进化关系、基本理化性质及其三维结构进行分析;将玉米象COX Ⅲ基因分别与载体pEASY-Blunt E1、pET28a、pET30a、pET32a、pET42a连接,构建原核表达载体pEASY-Blunt E1-COXⅢ、pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、pET32a-COXⅢ、pET42a-COXⅢ并分别转化至大肠杆菌BL21 (DE3)中,在不同IPTG诱导浓度、温度以及时间内诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot(wB)对表达结果进行验证.[结果]获得的玉米象COXⅢ基因全长cDNA序列开放阅读框(ORF)为792 bp,编码263个氨基酸,编码的蛋白分子质量约为30 938.1Da,理论等电点pI 6.51,预测分子式为C1492H2154N338O362S10,不稳定系数为34.49,总平均亲水系数为0.492,为疏水的稳定蛋白.系统发育树显示玉米象与鞘翅目象鼻虫科昆虫米象进化关系最近.原核表达结果表明,该蛋白在1 8℃、1 mmol·L-1 IPTG诱导24 h的条件下即能实现融合蛋白的表达,可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blot印迹检测证实大肠杆菌BL21 (DE3)中表达了一个分子量约为62 kD的融合蛋白.[结论]成功从玉米象昆虫克隆得到COXⅢ全长cDNA序列,并实现了其编码蛋白的原核表达,可为后续探究玉米象COXⅢ功能和异硫氰酸酯类化合物对玉米象的作用机理提供理论依据.