基于甲基化反应系统检测SETD3甲基化组蛋白的位点

• 作者: 刘靖华 姜勇 孙江 李月 罗海华 钟玙沄 黄梦怡 黄穗
• 来源期刊: 生物技术
• 学科: 生物学
• 关键词: GST-SETD3 重组蛋白原核表达 蛋白纯化 甲基化反应 甲基转移酶
• 年，卷（期）: 2017,（3）
• 所属期刊栏目: 技术与方法
• 页码范围: 245-251
• 页数: 7页
• 分类号: Q518.4|Q786
• 语种: 中文
• DOI: 10.16519/j.cnki.1004-311x.2017.03.0040

摘要

[目的]构建pEGX-4T-1-Setd3,表达并纯化GST-SETD3蛋白;用获得的蛋白进行体外甲基化反应并鉴定其活性,建立体外甲基化反应系统.[方法] PCR扩增小鼠全长Setd3,插入到pEGX-4T-1载体获得pEGX-4T-1-Setd3质粒.将质粒转化大肠杆菌,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST-SETD3蛋白并进行纯化.将获得的GST-SETD3蛋白定量后进行体外组蛋白甲基化反应,用Western Blot检测GST-SETD3对组蛋白H3K4及H3K36的甲基化情况.[结果]pGEX-4T-1-Setd3质粒构建正确,纯化的GST-SETD3蛋白纯度较高;甲基化反应结果表明,用不同来源的组蛋白、反应时间、反应缓冲液及检测方法均检测不到GST-SETD3二甲基化H3K4;GST-SETD3可以二甲基化H3K36.[结论]成功表达和纯化GST-SETD3蛋白;该蛋白可以使H3K36发生二甲基化,但不能使H3K4二甲基化.成功构建体外甲基化反应系统.