重组氨基脲敏感型胺氧化酶在293T 细胞中的定位及 酶活性测定

• 作者: 施金婉 李蕊 林哲绚 罗文鸿 罗红军 钱九战
• 来源期刊: 癌变·畸变·突变
• 学科: 生物学
• 关键词: 氨基脲敏感型胺氧化酶 重组表达 亚细胞定位 酶活性测定
• 年，卷（期）: 2017,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 277-283
• 页数: 7页
• 分类号: Q782
• 字数: 4629字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1004-616x.2017.04.007

摘要

目的:构建氨基脲敏感型胺氧化酶(SSAO)基因真核表达载体,并在293T细胞中进行瞬时表达,确定SSAO体外表达效率、亚细胞定位及酶活性.方法:以pcDNA3-SSAO质粒为模板,PCR扩增获取SSAO编码区全序列,分别构建SSAO与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达质粒pEGFP-N3-SSAO和共表达质粒pIRES2-EGFP-SSAO,并通过酶切和测序验证.再分别将pcDNA3-SSAO、pEGFP-N3-SSAO、pIRES2-EGFP-SSAO和pcFLAG-SSAO重组质粒瞬时转染293T细胞,在荧光显微镜下观察目的蛋白的分布及表达情况.采用高效液相色谱法(HPLC)测定转染上述4种重组质粒及相应空质粒细胞的SSAO活性.结果:测序结果表明重组真核表达质粒构建正确.在瞬时转染pEGFP-N3-SSAO和pIRES2-EGFP-SSAO重组质粒的293T细胞中,转染后3~36 h各组均可观察到绿色荧光,且转染36 h为最佳观察时间点.转染pIRES2-EGFP-SSAO质粒的绿色荧光分布于细胞质中;转染pEGFP-N3-SSAO和pcFLAG-SSAO质粒的绿色荧光及红色荧光均分布于细胞膜上.酶活性检测结果显示转染pcFLAG-SSAO、pIRES2-EGFP-SSAO和pcDNA3-SSAO载体质粒的293T细胞中的SSAO活性分别为111.50±7.07、117.22±9.54、215.74±21.44 nmoL/(mg·h),较各自的空白质粒对照组均显著升高(P均<0.01),但转染pEGFP-N3-SSAO质粒的细胞SSAO活性极低,仅为2.09±0.29 nmoL/(mg·h).结论:293T细胞中,体外重组表达的SSAO蛋白主要分布于细胞膜上,以pcDNA3为载体外源表达的天然状态SSAO活性最高.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	罗文鸿	汕头大学医学院生物分析实验室	65	364	11.0	15.0
2	罗红军	汕头大学医学院生物分析实验室	18	46	4.0	5.0
3	林哲绚	汕头大学医学院生物分析实验室	39	205	8.0	12.0
4	李蕊	汕头大学医学院生物分析实验室	20	47	4.0	6.0
5	钱九战	汕头大学医学院生物分析实验室	1	0	0.0	0.0
6	施金婉	汕头大学医学院生物分析实验室	1	0	0.0	0.0