家蚕碱性磷酸酶原核表达纯化、结构与活性分析

• 作者: 位曙光 何华伟 侯丽 李瑜 王叶菁 蒋文超 赵朋 赵萍
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 家蚕 碱性磷酸酶 表达纯化 结构 性质
• 年，卷（期）: 2017,（14）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·资源昆虫
• 页码范围: 2837-2850
• 页数: 14页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2017.14.019

摘要

[目的]碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)是生物体内磷酸代谢的关键调控酶.不同物种ALP的性质与其生理功能密切相关.研究家蚕(Bombyxmori)ALP(BmALP)的性质和结构,为揭示ALP在昆虫体内的生理功能和调控机制提供依据.[方法]取5龄3d家蚕中肠组织,利用Trizol法提取总RNA,然后以其为模板反转录合成cDNA.以家蚕中肠cDNA为模板,利用Primer Premier 6.0软件分别设计上下游引物,通过PCR克隆BmALP.将BmALP与不同的表达载体分别进行双酶切,然后连接并转化表达菌株,利用大肠杆菌表达重组蛋白.比较不同表达载体在上清中的表达情况,选择可溶性重组蛋白表达最好的载体,利用Origami B(DE3)细胞大量表达重组蛋白,借助Ni-NTA亲和层析纯化重组的His-Trx-BmALP蛋白,然后加入Prescission蛋白酶在4℃酶切20h,再次利用Ni-NTA亲和层析去除融合标签His-Trx.利用凝胶过滤层析分析BmALP分子量及其在溶液中的状态,利用圆二色光谱研究BmALP的二级结构及其随温度的变化.通过酶活分析研究BmALP的最适pn、最适温度、Km、结构稳定性及金属离子对其酶学活性的影响.[结果]从家蚕中肠组织提取了总RNA,反转录合成了cDNA,并以该cDNA为模板成功克隆了BmALPo分别构建了BmALP的pSKB2、ppSUMO和pET32M.3C 3种表达载体.表达分析发现,pET32M.3C载体有助于重组的融合蛋白His-Trx-BmALP以可溶性蛋白的形式在细胞裂解后的上清液中表达,然后利用pET32M.3C载体大量表达重组蛋白,并通过Ni-NTA亲和层析纯化获得了可溶性的His-Trx-BmALP.加入Prescission蛋白酶酶切,再次通过Ni-NTA亲和层析去除了融合标签His-Trx.凝胶过滤分析显示BmALP在溶液中形成稳定的二聚体结构.圆二色光谱研究表明BmALP包含有α一螺旋结构,其含量随温度的升高逐渐减少.酶活分析揭示BmALP的最适pH和最适温度分别为11.0和45℃.测定BmALP的Km值为1.40 mmol·L-1.在10℃处理2h后,BmALP的残余活性最高;35℃处理2h后,其活性完全丧失.Mg2+和Zn2+促进了BmALP催化反应的进行,其最适浓度分别为40和5 mmol·L-1.在20mmol·L-1浓度范围内,Cu2+激活了BmALP活性,其中10 mmol·L-1时激活效果最好,浓度超过20 mmol·L-1时,Cu2+则抑制了BmALP活性.[结论]克隆了家蚕碱性磷酸酶基因BmALP,表达纯化了BmALP蛋白并分析了其结构和性质,为深入研究其结构和功能打下了基础.