基于FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法

• 作者: 丁朋晓 李涛 王慧 王琴 罗森
• 来源期刊: 安徽医科大学学报
• 学科: 医学
• 关键词: FRET 肉毒毒素 破伤风毒素 高通量筛选
• 年，卷（期）: 2018,（5）
• 所属期刊栏目: 基础医学研究
• 页码范围: 739-745
• 页数: 7页
• 分类号: R378.8
• 字数: 5141字
• 语种: 中文
• DOI: 10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2018.05.016

摘要

目的 利用FRET技术构建破伤风毒素和B型肉毒毒素酶类抑制剂高通量体外筛选方法.方法 构建针对破伤风毒素和B型肉毒毒素的双荧光标记底物的重组表达质粒,表达并纯化荧光标记底物重组蛋白;利用A型肉毒毒素轻链(ALc),B型肉毒毒素轻链(BLc)和破伤风毒素轻链(TIc)分别对目的蛋白进行酶切反应.对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件进行优化.酶动力学参数分别测定TLc和BLc切割底物荧光标记底物的Km和Kcat值.结果 设计并成功构建荧光标记底物的重组表达质粒.表达并纯化后获得纯度为90％左右的重组蛋白,命名为CY-VAMP.利用ALc、BLc和TLc分别对CYVAMP进行酶切,CYVAMP能被BLc和TLc识别切割而不能被ALc切割.对基于双荧光标记底物高通量体外筛选方法的条件优化得到:CYVAMP较适宜的范围为0.2～32 μ.mol/L,酶标仪滤光片灵敏度设定的较合适的设置范围在65～110;(对于96孔板)动态实时检测间隔时间2 min较为合适,检测持续时间从30 min到120 min较合适.CYVAMP在内肽酶BLc作用下随反应时间变化与荧光值528与485比值作图最大时在1.5左右,最小在0.5左右.酶动力学参数测定得到BLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(17.6±2.6)μmol/L和(4.16+0.28) s-1.TLc酶切CYVAMP的Km和Kcat值分别为(40.8±3.5)μmol/L和(2.65±0.32)s-1.结论 成功构建基于FRET技术的分析法能满足对破伤风毒素和B型肉毒毒素的检测及抑制剂的高通量体外筛选所需.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	丁朋晓	遵义医药高等专科学校病原生物与免疫教研室	15	34	2.0	5.0
2	罗森	遵义医药高等专科学校病原生物与免疫教研室	6	4	1.0	2.0