丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用

• 作者: 司书毅 彭宗根 李健蕊 武燕彬 蒋建东 陈鸿珊
• 来源期刊: 中国医学科学院学报
• 关键词: 丙型肝炎病毒 丝氨酸蛋白水解酶 高通量筛选模型 荧光共振能量转移
• 年，卷（期）: 2011,（1）
• 页码范围: 98-101
• 分类号: R373-33
• 语种: 中文
• DOI: 10.3881/j.issn.1000-503X.2011.01.022

摘要

目的 应用荧光共振能量转移(FRET)法检测丙型肝炎病毒(HCV)丝氨酸蛋白水解酶(NS3 - 4A)活性,建立HCV蛋白酶抑制剂筛选模型.方法 将质粒pMAL-c2/NS3 - 4A转化到大肠杆菌K12TB1中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,亲和层析柱纯化得到麦芽糖结合的NS3 - 4A融合蛋白,用FRET法测定蛋白水解酶活性,建立特异性蛋白酶抑制剂筛选模型,优化反应体系,评价模型的可靠性.结果 建立了HCV蛋白酶抑制剂高通量筛选模型,经优化确定了酶及底物用量.在模型可靠性评价中,Z因子高达0.80,变异系数为1.91%.蛋白酶的Km值为4.74 μmol/L,测得已知HCV蛋白酶抑制剂BILN 2061的Ki值为0.30 nmol/L.结论 建立的HCV丝氨酸蛋白酶抑制剂FRET法筛选模型稳定可靠,适用于高通量筛选.