脐血单核细胞体外高效扩增NK细胞方法的研究

• 作者: 周越 汪德海 郭昌龙 马旭 高建恩
• 来源期刊: 中国输血杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 脐血 单核细胞 自然杀伤细胞 体外扩增 肿瘤细胞 K562 细胞毒
• 年，卷（期）: 2018,（7）
• 所属期刊栏目: 基础医学与实验研究
• 页码范围: 722-726
• 页数: 5页
• 分类号: Q813.1+1|R392.12|R457.7
• 语种: 中文
• DOI: 10.13303/j.cjbt.issn.1004-549x.2018.07.007

摘要

目的 建立1种使用脐血单核细胞(UCBMC)制备较高纯度自然杀伤(NK)细胞的体外高效扩增方法,并初步鉴定扩增后的NK细胞杀伤肿瘤细胞(K562)的能力.方法 6人份脐血标本来自北京妇产医院,取20 mL/份、采用密度梯度离心法分离脐血中的UCBMC,提取后的UCBMC以1×106个/mL细胞在4 mL含有白细胞介素(IL)-2、IL-12、IL-15和IL-21的X-VIVO15中培养5d,期间于d2和d3添加等体积含上述细胞因子的新鲜培养基;800 g离心将细胞后转入含1 000 IU/ml IL-2和50 ug/mL L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐的X-VIVO15培养基中继续培养至14 d,800 g离心收获细胞.无血清RPMI1640重悬后通过台盼蓝染色法做细胞计数测定细胞的扩增倍数;流式细胞仪检测NK细胞重要表面标志物(CD56和CD16等)及与杀伤功能相关的重要分子[CD158a、CD158b、CD158e/k、CD69、CD314(NKG2D)、CD94、CD335 (NKp46)、CD337 (NKp30)、CD62L、CD226(DNAM-1)、CD57和CD336(NKp44)]的表达情况;胞内染色结合流式细胞仪测定细胞杀伤重要效应分子Peffofin和Granzyme B的表达情况,并以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测扩增后的细胞对K562细胞的杀伤能力.结果 6份UCBMC培养14 d:活细胞总数从培养前的4×106个扩增至(3.6-5.5)×108个,扩增倍数91-137(116±13.1);CD3-CD56+细胞(NK细胞)占比85.6％-95.5％(90.2±3.4)％;培养得到的NK细胞表面除表达CD56分子外,还表达CD16(91.2±2.6)％、CD158a(71.4±4)％、CD158b(52.1±2.2)％、CD158e/k(50.3±6.9)％、CD69 (95.6±2.8)％、CD314(NKG2D)(94.2± 1.7)％、CD94(94.1±2.1)％、CD335(NKp46)(26.6±4.1)％、CD337 (NKp30)(94.6± 1.5)％、CD62L(12.8±3.4)％、和CD226(DNAM-1)(97.6±1.3)％,以及CD57(4.2±0.9)％和CD336(NKp44)(7.1±1)％.胞内染色结果显示:＞90％扩增产物(细胞)内表达与NK细胞杀伤功能相关的Perforin(86.9±2.7)％和Granzyme B(94.1±2.9)％;体外细胞杀伤试验:扩增的细胞对K562在效靶比为5∶1和10∶1时对靶细胞(K562)具有明显的杀伤作用.结论 成功建立了1种从UCBMC不经纯化直接制备高纯度NK细胞的方法——其培养的细胞中表达了NK细胞重要的功能性分子,对K562细胞具有杀伤能力.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	马旭	国家卫生健康委员会科学技术研究所国家人类遗传资源中心	49	138	6.0	10.0
2	周越	国家卫生健康委员会科学技术研究所国家人类遗传资源中心	5	14	2.0	3.0
3	郭昌龙	国家卫生健康委员会科学技术研究所国家人类遗传资源中心	3	2	1.0	1.0
4	汪德海	国家卫生健康委员会科学技术研究所国家人类遗传资源中心	3	0	0.0	0.0
5	高建恩	国家卫生健康委员会科学技术研究所国家人类遗传资源中心	3	0	0.0	0.0