应用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠海马神经元中Purα基因可减弱神经元对DNA损伤的修复作用

• 作者: 何文欣 刘昆梅 孙涛 崔建奇 张冰莹 石晓光 郭姗姗
• 来源期刊: 中国细胞生物学学报
• 关键词: CRISPR/Cas9 Purα 基因敲除 羟基脲 细胞损伤修复
• 年，卷（期）: 2018,（5）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 706-716
• 页数: 11页
• 语种: 中文
• DOI: 10.11844/cjcb.2018.05.0323

摘要

人转录活化因子Purα是体内重要的转录因子,在体内多个环节中都发挥着重要的作用,尤其是在神经系统中,它与神经元的发育,突触形成都有很密切的关系.该文通过构建Purα基因敲除的小鼠海马神经元细胞系来观察其在DNA损伤修复中的作用.根据目的基因靶向删除外显子的位置设计相应的sgRNA序列,合成相应的寡核苷酸后克隆在pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒载体相应位点上,从而构建能对Purα基因进行敲除的CRISPR/Cas9质粒,将构建好的质粒通过酶切和测序进行鉴定,将经过鉴定证实相位正确及在有sgRNA序列插入的阳性质粒转染到小鼠海马神经元(HT22)细胞中,加入嘌呤霉素进行抗性筛选,保留正常生长的细胞进行培养,从而建立能稳定地进行Purα基因敲除的细胞系.通过Real-time PCR和Western blot技术分别在转录和翻译水平上检测Purα基因的表达情况,从而来判定Purα基因的敲除效率;将所构建的Purα基因敲除的细胞用羟基脲(HU)进行处理来建立细胞DNA损伤的实验模型,通过Western blot、脉冲电场反转凝胶电泳实验及细胞毒性实验观察Purα在DNA损伤修复中的作用.实验结果证实,所插入片段相位正确.通过 TA克隆测序和T7E1酶切证实所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性,可导致基因组碱基发生突变,Real-time PCR和Western blot实验结果证实,Purα基因敲除组的Purα基因表达明显降低.Purα基因敲除后,细胞对HU引起的DNA损伤极为敏感,说明Purα在维持基因组DNA的完整性方面发挥着重要的作用,是细胞中一种不可或缺的蛋白质.该实验结果还提示,利用CRISPR/Cs9技术可以有效地对目的基因进行敲除,同时由于该质粒携带有嘌呤霉素抗性基因,利用这一特点,可以方便地建立稳定的细胞系,该细胞系可用作研究Purα基因在神经元中的生物学功能的细胞模型.