禽致病性大肠杆菌HPI毒力岛irp2蛋白表达、纯化及其间接ELISA方法建立

• 作者: 刘吉山 徐倩倩 李风叶 沈志强 王艳萍 苗立中 莫玲 董林 郭时金
• 来源期刊: 中国兽医学报
• 学科: 农学
• 关键词: 大肠杆菌 毒力岛 irp2 ELISA
• 年，卷（期）: 2018,（2）
• 所属期刊栏目: 预防兽医学
• 页码范围: 287-292,300
• 页数: 7页
• 分类号: S855.12
• 语种: 中文
• DOI: 10.16303/j.cnki.1005-4545.2018.02.10

摘要

PCR扩增irp2主要抗原表位区,构建pET-32α-irp2表达载体,转化BL21(DM3)细胞诱导表达.以纯化irp2蛋白为抗原建立ELISA检测方法,确定抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液与封闭条件和临界值等参数,进行ELISA性能检测及应用.结果显示,PCR扩增出约519 bp特异性irp2主要抗原表位基因,经菌液PCR、双酶切及DNA测序显示成功构建pET-32α-irp2表达载体.irp2目的蛋白获得有效表达,相对分子质量大小约34 500,亲和纯化后纯度达90％以上.Western blot显示目的蛋白irp2与抗血清在约34 500出现特异性显示条带.确定ELISA抗原包被质量浓度3.25 mg/L、血清稀释度1∶80,封闭液为5％脱脂奶粉,封闭条件37℃1 h+4℃10h,临界值为0.320.性能检测显示,其敏感性可达1∶5 120;与鸡白痢沙门菌、鸡传染性鼻炎、鸡霉形体、鸡巴氏杆菌、HPI大肠杆菌等血清无交叉反应特异性,批内、批间变异系数分别为3.40％～6.71％和5.20％～8.44％;与PCR方法对124份血清平行试验其符合率93.8％;对1 425份临床血清样品irp2抗体阳性检出率37.4％.结果表明,建立了可检测血清中irp2蛋白抗体的间接ELISA方法,适用于临床血清样品进行快速抗体检测,为HPI大肠杆菌的流行病学调查和致病性大肠杆菌免疫机制研究奠定基础.