稳定表达EGFRvⅢ胶质瘤细胞株的建立

• 作者: 李修岭 赵静静 郑岩 雷舒婷 韩双印
• 来源期刊: 中国实用医刊
• 关键词: 表皮生长因子受体Ⅲ型突变体 脑胶质瘤 U87
• 年，卷（期）: 2018,（7）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 1-3
• 页数: 3页
• 字数: 2744字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1674-4756.2018.07.001

摘要

目的 构建稳定表达表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)的胶质瘤U87细胞株.方法 首先EGFRvⅢcDNA (2832bp)克隆入pCDH-CMV-MCS-EF1-puro的XbaⅠ和NotⅠ位点,引物中添加His6标签,测序鉴定;用磷酸钙沉淀法将含目的基因的质粒pCDH-CMV-EGFRvⅢ-EF1-puro与慢病毒包装质粒pCMV-dR8.9和包膜蛋白质粒pVSV-G三质粒共转染293T细胞.过滤、浓缩包装好病毒后,利用稀释计数法测定病毒滴度.制备好的慢病毒感染U87细胞,经嘌呤霉素筛选、有限稀释克隆培养建立稳定表达细胞株.Western blot采用人EGFRvⅢ单抗、His6单抗检测筛选的细胞株,流式细胞术检测EGFRvⅢ在U87细胞表面的表达.结果 重组质粒pCDH-EGFRvⅢ经Xba Ⅰ和Not Ⅰ双酶切、1％琼脂糖凝胶电泳,产物与预期目的基因EGFRvⅢcDNA(2832 bp)大小一致;Western blot鉴定6株U87-vⅢ均表达EGFRvⅢ蛋白(145 kd)和His6(145 kd);流式细胞术检测2株U87-vⅢ细胞株(U87-vⅢ-2、U87-vⅢ-4)表面均表达EGFRvⅢ蛋白(分别为93.1％、96.9％).结论 稳定表达EGFRvⅢ的U87细胞株被成功建立,为胶质瘤的靶向治疗研究提供了基础.