血小板CD36缺失个体永生化淋巴母细胞株的建立及验证

• 作者: 刘学军 卢芳 吴国光 李丽兰 蒋丽红 黎海燕
• 来源期刊: 国际输血及血液学杂志
• 关键词: 抗原,CD36 血小板 疱疹病毒4型,人 细胞株 淋巴母细胞株
• 年，卷（期）: 2019,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 305-312
• 页数: 8页
• 字数: 5837字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.issn.1673-419X.2019.04.005

摘要

目的 探讨血小板CD36缺失个体永生化淋巴母细胞株的构建及验证方法.方法 选择2012年1月至2018年1月经相关检测确定为血小板CD36缺失的8例个体为研究对象.其中,6例为于南宁中心血站参与献血的无偿献血者,1例为广西923医院收治的血小板输注无效(PTR)患者,1例为广西壮族自治区妇幼保健院收治的胎儿/新生儿同种免疫血小板减少症(FNAIT)患儿母亲.全部受试者年龄为15～66岁,研究前期经流式细胞术与血小板抗原单克隆抗体特异性免疫固定试验(MAIPA)及CD36基因分型等技术的检测,鉴定为血小板CD36缺失者,其中1例为CD36基因538T>C突变杂合子,3例为380C>T突变杂合子,1例为329-330del突变纯合子,3例为329-330del突变杂合子.采集受试者肝素抗凝血5 mL,并且分离淋巴细胞.采用EB病毒(EBV)与环孢素处理血小板CD36缺失个体的外周血淋巴细胞,获得永生化淋巴母细胞株,稳定传代后冻存,并且对这些细胞株进行复苏活性与支原体检测,同时进行CD36基因的测序验证.本研究遵循的程序符合2013年修订版《世界医学会赫尔辛基宣言》的要求,征得受试者的知情同意,并与之签署知情同意书.结果 ① 受试者外周血淋巴细胞经EBV与环孢素处理后,继续培养7 d后,细胞母细胞化,细胞边缘多刺,部分细胞凝集呈团状.持续更换全培养液约1个月,细胞大量增殖,生长旺盛,肉眼可见较多克隆球形成,成功获得CD36缺失永生化淋巴母细胞株.②CD36缺失永生化淋巴母细胞株传代20代后,冻存于液氮;全部CD36缺失永生化淋巴母细胞株均复苏成功,倒置相差显微镜下观察细胞株生长状态良好.③CD36缺失永生化淋巴母细胞株支原体检测结果示阴性.④ 对CD36缺失永生化淋巴母细胞株DNA进行PCR扩增测序结果显示,其与建株前血小板CD36缺失个体的CD36基因型完全一致,没有发生基因突变.本研究建立的CD36缺失永生化淋巴母细胞株基因类型包括CD36基因538T>C突变杂合子(1例),380C>T突变杂合子(3例),329-330del突变纯合子(1例),329-330del突变杂合子(3例).结论 CD36缺失永生化淋巴母细胞株传代稳定,血小板CD36缺失个体的基因能够稳定地被保存,并且为CD36基因相关的血小板免疫学等方面研究提供永久性实验材料.