棉花CRVW的克隆与抗黄萎病功能分析

• 作者: 吴立强 张桂寅 张艳 杨君 王伟巧 王国宁 王省芬 王秋莹 马峙英
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 棉花 黄萎病 CRVW 克隆 病毒诱导的基因沉默 抗性
• 年，卷（期）: 2019,（11）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
• 页码范围: 1858-1869
• 页数: 12页
• 字数: 7814字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.11.002

摘要

[目的]黄萎病(Verticillium wilt)是棉花生产上的重要病害,严重影响棉花的产量和品质.棉花基因组测序工作的完成为抗病基因挖掘提供了重要的信息资源.通过对一个尚未有功能注释的陆地棉基因CRVW(cotton resistance to Verticillium wilt)进行克隆与抗病功能验证,为棉花基因组信息完善、抗病机制解析和分子育种等方面奠定基础.[方法]根据参考基因组序列设计引物,同源克隆陆地棉(Gossypium hirsutum)农大601 (ND601)中CR VW的开放读码框(open reading frame,ORF).利用在线工具ProtParam预测蛋白氨基酸组成、分子量、理论等电点、不稳定指数和总平均亲水性等性质;应用PSIPRED v3.3预测蛋白二级结构;在线工具ProtComp v.9.0进行亚细胞定位预测;PlantCARE在线软件分析顺式作用元件.构建CRVW与绿色荧光蛋白基因融合表达载体,通过基因枪介导法转化洋葱表皮细胞,观察CRVW的表达位置.利用qRT-PCR检测CRVW在棉花不同组织、黄萎病菌胁迫条件下不同抗、感品种间,以及水杨酸(salicylic acid,SA)诱导处理条件下的表达模式.构建CRVW沉默载体,应用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)技术进一步验证该基因在棉花中的抗病功能.检测CRVW沉默后一些与植物抗病调控相关标志基因的表达变化,分析其介导的抗病通路.[结果]从陆地棉品种ND601中克隆到CRVW的ORF,其全长780 bp,编码259个氨基酸残基,分子量约为30.2 kD,理论等电点9.59;蛋白二级结构含69.50％不规则卷曲、17.76％α-螺旋、11.20％延伸链和1.54％β-卷曲.综合生物信息学预测和荧光观察结果,显示CRVW主要存在于植物细胞膜和细胞质.CRVW在棉花根、茎和叶中都有表达,但在根中的表达量最高.CR VW的ORF上游序列(CRVW-P)中包括响应乙烯(ethylene)、SA、生长素(auxin)和脱落酸(abscisic acid)等4种激素信号的顺式作用元件.另外,CRVW-P还包括一些与伤害、防御、胁迫、病菌、干旱和低温等相关的顺式作用元件.SA喷洒处理后,CRVW显著上调表达.黄萎病菌胁迫后,CRVW在抗病品种ND601和感病品种中棉所8号(CCR18)中均显著上调表达,但在感病品种中上调表达的发生时间明显滞后.黄萎病菌处理20 d后,CRVW沉默组棉苗表现出比对照(CK)组更明显的黄化、萎蔫和落叶等黄萎病病症.进一步统计分析显示,CRVW沉默组病指显著高于CK组,表明CRVW沉默显著降低了棉苗对黄萎病菌的抗性.沉默CRVW后,棉苗中SA含量显著降低;ICS1(isochorismate synthase 1)、EDS1 (enhanced disease susceptibility 1)、PAD4(phytoalexin deficient 4)、NPR1 (nonexpresser of PRgene 1)和PR1 (pathogenesis-related protein 1)等与SA积累和信号调控相关的标志基因均发生显著下调表达.[结论]CRVW定位于细胞质和细胞膜,主要在棉花根部表达,可能通过SA信号通道参与棉花抗黄萎病反应过程.