紫花苜蓿MsGAI的克隆、表达及遗传转化

• 作者: 刘希强 张涵 温红雨 王学敏 王赞 马琳
• 来源期刊: 中国农业科学
• 关键词: 紫花苜蓿 DELLA蛋白 赤霉素 表达分析 同源克隆 遗传转化
• 年，卷（期）: 2019,（2）
• 所属期刊栏目: 作物遗传育种·种质资源·分子遗传学
• 页码范围: 201-214
• 页数: 14页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2019.02.002

摘要

[目的]DELLA蛋白属于GRAS家族,是赤霉素信号转导途径中重要的转录因子,负向调节GA转导途径.克隆获得紫花苜蓿GAI,分析其基因生物信息学特征并预测蛋白结构域.明确紫花苜蓿GAI组织表达特征及不同处理下的表达模式,构建该基因超表达载体并转入紫花苜蓿,以探究DELLA蛋白基因在紫花苜蓿赤霉素(GA)信号转导途径及胁迫条件下的作用机理.[方法]利用同源克隆的方法,从紫花苜蓿中克隆得到MsGAI.利用生物信息学方法分析该基因的序列特征,使用MEGA7.0对MsGAI蛋白序列及同源序列进行多序列比对,构建同源物种间的系统发育树.利用实时荧光定量PCR检测紫花苜蓿各组织GAI表达量以及在PEG、NaCl、GA、ABA和黑暗处理下,GAI的表达变化.同时对转基因GAI株系表达水平进行分析,选择表达量高、中、低株系(L5、L8、L11)分别进行PEG和NaC1处理,分析GAI的表达变化.以pBI121为基础载体,采用双酶切-连接的方法构建植物超表达载体35S:MsGAI-gus.将重组载体转入农杆菌GV3101菌株中,以紫花苜蓿叶片为外植体,采用农杆菌介导的愈伤组织转化法转化紫花苜蓿,经PCR检测和GUS组织化学染色,得到转基因阳性苗.[结果]该基因序列包含有一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸.生物信息学分析结果显示,MsGAI蛋白具有GRAS家族的典型结构域和保守区,其中包含N端保守结构域DELLA和TVHYNP,C端保守结构域SAW.多序列比对及系统进化树分析表明,该序列与其他物种的DELLA蛋白序列相似度均高达80％以上,将其命名为MsGAI.该基因与蒺藜苜蓿CAI亲缘关系最近,其次与鹰嘴豆、红三叶等双子叶豆科植物亲缘关系较近,与大麦等单子叶植物较远.实时荧光定量PCR分析表明,MsGAI在紫花苜蓿各组织中均有表达,根中的表达量最高.经PEG、NaCl、GA以及ABA处理后,均有明显响应;黑暗处理显著抑制MsGAI的表达.转基因株系经PEG、NaC1处理后,GAI表达量均上调.对构建完善的35S:MsGAI-gus植物超表达载体进行双酶切检测,琼脂糖凝胶电泳显示,条带大小与预期一致.对转基因植株进行GUS组织染色验证,结果表明,阳性植株呈现蓝色,对照组为白色.对超表达载体携带的MsGAI和GUS序列进行PCR检测均呈阳性.[结论]紫花苜蓿DELLA蛋白基因的克隆和超表达载体构建成功,MsGAI对逆境胁迫有响应.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	王赞	中国农业科学院北京畜牧兽医研究所	62	994	17.0	28.0
2	马琳	中国农业科学院北京畜牧兽医研究所	33	67	5.0	6.0
3	王学敏	中国农业科学院北京畜牧兽医研究所	25	179	9.0	12.0
4	刘希强	中国农业科学院北京畜牧兽医研究所	4	14	3.0	3.0
5	张涵	中国农业科学院北京畜牧兽医研究所	8	13	3.0	3.0
6	温红雨	中国农业科学院北京畜牧兽医研究所	2	7	2.0	2.0