禽流感病毒H9N2亚型HA蛋白在水稻胚乳中的稳定、高效表达及活性鉴定

• 作者: 张二芹 张以芳 张同旭 张改平 张申立 李雪洋 牛香香 王雅楠 许倩茹 赵翔玥 邓瑞广 马凡舒
• 来源期刊: 华北农学报
• 学科: 农学
• 关键词: 禽流感病毒 H9N2 HA蛋白 纯合子 水稻胚乳 活性鉴定
• 年，卷（期）: 2020,（4）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医
• 页码范围: 230-238
• 页数: 9页
• 分类号: S851.3
• 字数: 5305字
• 语种: 中文
• DOI: 10.7668/hbnxb.20191161

摘要

为了在体外获得表达量高、储存容易、成本低且免疫活性高的H9N2亚型HA蛋白,利用水稻胚乳表达系统表达HA蛋白.首先,将HA基因根据水稻偏好密码子进行优化,合成到pUC57载体上,通过双酶切、连接将HA基因先后构建到中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300上;再通过电极法将pCAMBIA1300-HA导入到根癌农杆菌EHA105中;然后用农杆菌侵染TP309水稻愈伤组织;最后经潮霉素筛选、分化、生根、移栽至田间种植.利用CTAB法提取叶片基因组DNA,PCR鉴定T0阳性植株;利用Dot Blot和Western Blot检测HA蛋白在水稻胚乳中的表达;提取阳性的T1叶片DNA,通过荧光定量PCR方法筛选纯合植株;利用温汤杀雄剪颖授粉法,将含有HA蛋白的TP309与低谷蛋白水稻杂交;利用Western Blot检测杂交后的T3植株蛋白表达量;利用双抗夹心ELISA方法比较水稻源和昆虫表达HA蛋白的活性.结果显示,成功构建了中间载体pMP3-HA和植物表达载体pCAMBIA1300-HA,且pCAMBIA1300-HA成功导入到根癌农杆菌EHA105中;PCR检测到有66株植株的HA基因成功整合到水稻基因组;Dot Blot和Western Blot检测结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达;利用荧光定量PCR方法,107株T1中筛选到31株纯合植株;Western Blot检测结果表明,杂交后的HA蛋白表达量大幅度提高;双抗夹心ELISA结果证实,水稻胚乳表达的HA蛋白的活性高于杆状病毒-昆虫细胞.