侵染中华蜜蜂6日龄幼虫的蜜蜂球囊菌的微小RNA差异表达谱及调控网络

• 作者: 冯睿蓉 史小玉 周丁丁 杜宇 熊翠玲 王杰 王海朋 祝智威 范元婵 范小雪 蒋海宾 郑燕珍 郭睿 陈华枝 陈大福
• 来源期刊: 微生物学报
• 关键词: 蜜蜂球囊菌 中华蜜蜂 幼虫 微小RNA 调控网络 侵染机制 跨界调控
• 年，卷（期）: 2020,（5）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 992-1009
• 页数: 18页
• 语种: 中文
• DOI: 10.13343/j.cnki.wsxb.20190421

摘要

[目的]蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,简称球囊菌)是专性侵染蜜蜂幼虫的致死性真菌病原.MicroRNA(miRNA)作为一类重要的基因表达调控因子,能够广泛参与真菌及其宿主的相互作用过程.本研究通过比较分析球囊菌孢子(AaCK)和侵染中华蜜蜂(Apis cerana cerana,简称中蜂)6日龄幼虫肠道内的球囊菌(AaT)的small RNA (sRNA)组学数据对球囊菌的差异表达miRNA (differentially expressed miRNA,DEmiRNA)、靶mRNA及二者间的调控网络进行全面解析,旨在揭示miRNA介导的球囊菌对中蜂幼虫的侵染机制.[方法]对于球囊菌侵染的中蜂6日龄幼虫肠道的small RNA-seq (sRNA-seq)数据,利用BLAST工具连续比对东方蜜蜂(Apis cerana)和球囊菌的参考基因组筛滤得到AaT的sRNA组学数据.分别将AaCK和AaT的sRNA组学数据比对miRBase数据库,对球囊菌侵染宿主前后miRNA的数量和结构特征进行分析.联用RNAhybrid+svm_light、Miranda和TargetScan软件预测AaCK vs AaT比较组中DEmiRNA的靶mRNA,进而利用相关生物信息学软件对上述靶mRNA进行GO分类和KEGG代谢通路富集分析.通过Cytoscape软件对DEmiRNA-mRNA调控网络进行可视化.利用Stem-loop RT-PCR、RT-qPCR和分子克隆验证测序结果的可靠性.[结果]在AaCK和AaT中分别鉴定到380和387个miRNA.结构特征分析结果显示,AaCK和AaT的miRNA皆集中分布在18-25 nt,且首位碱基主要偏向于U.AaCK vs AaT比较组共有270个DEmiRNA,包含155个上调miRNA和115个下调miRNA,分别靶向结合6091和6145个mRNA.GO分类结果显示,上述靶mRNA主要涉及代谢进程、细胞进程、应激反应等15个生物学进程;细胞、细胞组分、细胞器等12个细胞组分;催化活性、结合、转运子活性等11个分子功能.KEGG代谢通路富集分析结果显示,上述靶mRNA富集在123条代谢通路,参与对氨基酸代谢、碳水化合物代谢以及核苷酸代谢等物质代谢,氧化磷酸化、硫代谢、氮代谢等能量代谢,以及MAPK和Hippo等信号通路的调控.球囊菌DEmiRNA与靶mRNA之间存在复杂的调控关系,其中miR-29-x、miR-250-x、miR-4968-y、miR-11200-x、novel-m0023-5p、novel-m0130-5p和novel-m0135-5p等DEmiRNA可靶向结合与球囊菌的半胱氨酸蛋白酶、DNA甲基化转移酶以及几丁质酶相关的mRNA;此外,miR-7-x、miR-9-z、miR-319-y和miR-5951-y等同时参与调控MAPK信号通路;进一步分析发现,miR-250-x同时参与对DNA甲基化转移酶、MAPK信号通路及其他酶类合成与代谢途径的调控,并可能参与球囊菌与中蜂6日龄幼虫之间的跨界调控.通过Stem-loop RT-PCR和RT-qPCR验证了4个DEmiRNA的差异表达,并利用分子克隆和Sanger测序证实miR-7-x的序列与测序结果一致.[结论]本研究解析了侵染中蜂6日龄幼虫的球囊菌的miRNA差异表达谱及DEmiRNA的调控网络,揭示了球囊菌DEmiRNA可能通过调控病原的物质和能量代谢、增殖、毒力、信号通路及相关mRNA参与对中蜂幼虫的侵染过程.miR-7-x、miR-250-x、novel-m0023-5p等关键DEmiRNA有望作为白垩病治疗的新型分子靶点.