甲型肝炎病毒细胞膜蛋白受体2促进小鼠巨噬细胞内毒素耐受形成的研究

• 作者: 刘垚 刘逸 张小禾 陈睦虎 胡迎春
• 来源期刊: 中华危重病急救医学
• 关键词: 甲型肝炎病毒细胞膜蛋白受体2 内毒素耐受 脓毒症 生物信息学
• 年，卷（期）: 2021,（4）
• 所属期刊栏目: 论著·基础研究
• 页码范围: 472-477
• 页数: 6页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/cma.j.cn121430-20201106-00705

摘要

目的:寻找内毒素耐受（ET）的潜在关键基因，为脓毒症的治疗提供理论和实验依据。方法:①实验1（基因芯片与生物信息分析）：从基因表达数据库（GEO）中下载ET相关基因数据集GSE47783，该数据集由脂多糖（LPS）刺激小鼠巨噬细胞建立脓毒症模型（LPS组）和ET模型（ET组）后进行实验获得；利用IDEP 0.92软件筛选数据集中两组差异表达基因（DEG），同时进行基因本体（GO）分析，并定位DEG主要富集的功能和信号通路。利用基因与蛋白质相互作用检索数据库（STRING），针对DEG构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络，筛选出核心基因甲型肝炎病毒细胞膜蛋白受体2（HAVCR2）进行后续验证研究。②实验2（小鼠巨噬细胞株RAW264.7模型制备）：体外培养RAW264.7细胞，通过LPS刺激制备ET模型（ET组，用10 μg/L的LPS培养24 h后，再用100 μg/L的LPS培养4 h）和脓毒症模型（LPS组，用100 μg/L的LPS培养4 h）；磷酸盐缓冲液（PBS）组给予等体积溶媒PBS培养4 h。采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）检测细胞HAVCR2的mRNA及蛋白表达。③实验3（HAVCR2慢病毒载体转染RAW264.7细胞）：为进一步明确HAVCR2是否参与ET形成，用慢病毒短发夹RNA（shRNA）技术敲低RAW264.7细胞中的HAVCR2后，再制备ET模型（HAVCR2 --ET组），并设非敲低HAVCR2的对照组（ET组）。采用RT-qPCR法检测细胞中巨噬细胞极化关键基因〔精氨酸酶1（ARG1）、CD206、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、一氧化氮合酶2（NOS2）〕的mRNA表达。 结果:①实验1：共获得1 013个DEG；与LPS组比较，ET组有521个上调基因，492个下调基因；这些DEG的功能主要为增加生物合成、抑制炎症反应，主要富集于Janus激酶/信号转导与转录激活因子（JAK/STAT）、NOD样受体、Toll样受体（TLR）、TNF、缺氧诱导因子-1（HIF-1）等信号通路。选择ET组第一个表达上调的膜蛋白HAVCR2作为验证研究的目标。②实验2：体外实验结果显示，经大剂量LPS处理后，RAW264.7细胞中HAVCR2 mRNA表达较PBS组明显下调；而ET组HAVCR2 mRNA表达明显高于LPS组（2 -ΔΔCT：1.10±0.10比0.60±0.10， P<0.05）；Western blotting检测结果与RT-qPCR结果一致。③实验3：与ET组相比，HAVCR2 --ET组细胞ARG1和CD206的mRMA表达明显降低〔ARG1 mRNA（2 -ΔΔCT）：0.50±0.10比1.00±0.10，CD206 mRNA（2 -ΔΔCT）：0.73±0.10比1.00±0.10〕，下游因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达明显升高〔TNF-α mRNA（2 -ΔΔCT）：2.20±0.10比1.00±0.10，IL-1β mRNA（2 -ΔΔCT）：9.00±0.10比1.00±0.10〕，差异均有统计学意义（均 P<0.05）；两组NOS2 mRNA表达差异无统计学意义。 结论:HAVCR2参与脓毒症下游炎性因子的调节，参与ET的形成，有望成为脓毒症新的治疗靶点。