神经生长因子过表达的人脐带血间充质干细胞来源外泌体修复大鼠坐骨神经慢性压迫损伤的效果及作用机制研究

• 作者: 郑良良 张弛
• 来源期刊: 中医正骨
• 关键词: 坐骨神经 大鼠 慢性压迫损伤 干细胞 神经生长因子 外泌体 动物实验
• 年，卷（期）: 2021,（9）
• 所属期刊栏目: 基础研究|Experimental research
• 页码范围: 3-14
• 页数: 12页
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1001-6015.2021.09.002

摘要

目的:探讨神经生长因子(nerve growth factor,NGF)过表达的人脐带血间充质干细胞(human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells,hUCB-MSCs)来源外泌体(exosome,Exo)修复大鼠坐骨神经慢性压迫损伤(chronic constriction injury,CCI)的效果及作用机制.方法:①取培养至第2代的hUCB-MSCs,采用流式细胞仪对其进行鉴定.②根据NGF基因序列,构建NGF过表达的慢病毒载体,包装后转染hUCB-MSCs,并测定hUCB-MSCs转染率.③采用超速离心法提取NGF过表达的hUCB-MSCs来源Exo(NGF-hUCB-MSCs-Exo),进行Exo形态及标志蛋白的鉴定.④采用不同的荧光染色试剂分别对hUCB-MSCs细胞核、细胞骨架及NGF-hUCB-MSCs-Exo进行染色,在荧光显微镜下观察hUCB-MSCs摄取内化NGF-hUCB-MSCs-Exo.⑤从20只雄性Sprague Dawley大鼠中选取15只,采用手术建立坐骨神经CCI模型,分别于术后第1天、第3天、第5天、第7天采用IITC动物热痛刺激仪测定大鼠机械刺激缩足反射阈值(paw withdrawal mechanical threshold,PWMT)和热刺激缩足反射潜伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL),评价造模是否成功.⑥分别采用空载体慢病毒和NGF过表达慢病毒转染hUCB-MSCs,制备空载体慢病毒转染hUCB-MSCs来源Exo(hUCB-MSCs-Exo)和NGF-hUCB-MSCs-Exo.将15只坐骨神经CCI模型大鼠随机分为坐骨神经CCI模型组、hUCB-MSCs-Exo注射组和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组,每组5只;将剩余5只正常大鼠纳入正常对照组.正常对照组大鼠不做任何处理,坐骨神经CCI模型组大鼠于尾静脉注射1 mL PBS,hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠于尾静脉注射1 mL hUCB-MSCs-Exo和hUCB-MSCs混合液,NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠于尾静脉注射1 mL NGF-hUCB-MSCs-Exo与hUCB-MSCs混合液,每周注射1次,连续注射3周.3周后处死大鼠,取L4～L5制备冷冻切片,进行HE染色,采用Allen脊髓后角灰质病变评分标准评价脊髓后角灰质的病理变化;进行TUNEL染色,于显微镜下观察,评价L4～L5脊髓组织的细胞凋亡情况;提取大鼠脊髓组织总蛋白,采用蛋白印迹法检测大鼠脊髓组织中NOD样受体蛋白3(NOD-like re-ceptor protein 3,NLRP3)、白细胞介素(interleukin,IL)-1、兔抗鼠半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine aspartic acid specific protease,Caspase)-1和Caspase-3的蛋白表达量.结果:①hUCB-MSCs鉴定结果.流式细胞仪检测第2代hUCB-MSCs,CD34阳性率0.4％,CD45阳性率0.6％,CD90阳性率95.8％,CD105阳性率98.3％,符合hUCB-MSCs表面蛋白表达特征.②重组慢病毒转染结果.重组慢病毒转染72 h,hUCB-MSCs转染率(89.22±6.91)％.③NGF-hUCB-MSCs-Exo鉴定结果.透射电子显微镜结果显示,NGF-hUCB-MSCs-Exo为杯口状结构.蛋白印迹法检测结果显示,NGF-hUCB-MSCs-Exo标志蛋白CD63、CD9和CD81表达量高于hUCB-MSCs,表明Exo提取成功.④hUCB-MSCs摄取内化NGF-hUCB-MSCs-Exo观察结果.hUCB-MSCs与NGF-hUCB-MSCs-Exo共培养12 h后,观察到hUCB-MSCs摄取并内化NGF-hUCB-MSCs-Exo.⑤坐骨神经CCI模型建立结果.术后第1天、第3天、第5天、第7天,坐骨神经CCI模型大鼠的PWMT和PWTL均低于正常大鼠[PWMT:(3.05±0.06)g,(7.34±0.08)g,t=3.903,P=0.000;(3.07±0.04)g,(7.39±0.06)g,t=3.342,P=0.001;(3.11±0.05)g,(7.47±0.04)g,t=3.892,P=0.000;(2.89±0.02)g,(7.56±0.09)g,t=4.903,P=0.000;PWTL:(6.13±0.03)s,(18.12±0.45)s,t=3.562,P=0.000;(6.07±0.05)s,(18.09±0.36)s,t=3.769,P=0.000;(6.01±0.04)s,(18.77±0.44)s,t=3.809,P=0.000;(5.77±0.09)s,(18.37±0.39)s,t=4.651,P=0.000],表明造模成功.⑥病理学检查结果.正常对照组、坐骨神经CCI模型组、hUCB-MSCs-Exo注射组和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠Allen脊髓后角灰质病变评分比较,差异有统计学意义[(0.32±0.04)分,(4.21±0.11)分,(4.09±0.15)分,(1.89±0.17)分,F=11.714,P=0.000].坐骨神经CCI模型组、hUCB-MSCs-Exo注射组和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠Allen脊髓后角灰质病变评分均高于正常对照组(q=2.783,P=0.015;q=3.921,P=0.000;q=3.784,P=0.000);hUCB-MSCs-Exo注射组和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠Allen脊髓后角灰质病变评分均低于坐骨神经CCI模型组(q=2.059,P=0.024;q=2.071,P=0.021);NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠Allen脊髓后角灰质病变评分低于hUCB-MSCs-Exo注射组(q=2.809,P=0.013).⑦细胞凋亡检测结果.正常对照组、坐骨神经CCI模型组、hUCB-MSCs-Exo注射组和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠脊髓组织细胞凋亡率比较,差异有统计学意义[(0.15±0.02)％,(8.98±0.37)％,(8.14±0.29)％,(3.46±0.31)％,F=9.908,P=0.012)].坐骨神经CCI模型组、hUCB-MSCs-Exo注射组和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠脊髓组织细胞凋亡率均高于正常对照组(q=2.142,P=0.017;q=3.287,P=0.000;q=2.275,P=0.025);hUCB-MSCs-Exo注射组和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠脊髓组织细胞凋亡率均低于坐骨神经CCI模型组(q=2.021,P=0.021;q=2.086,P=0.024);NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠脊髓组织细胞凋亡率低于hUCB-MSCs-Exo注射组(q=3.008,P=0.011).⑧炎症反应和细胞凋亡相关基因的蛋白表达分析结果.正常对照组、坐骨神经CCI模型组、hUCB-MSCs-Exo注射组和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠脊髓组织中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和Caspase-3蛋白表达量比较,组间差异均有统计学意义(122.16±15.23,764.29±20.14,627.86±21.17,198.25±14.37,F=12.428,P=0.000;106.27±14.11,698.11±24.57,687.45±22.36,208.42±19.79,F=15.008,P=0.000;108.43±13.79,305.58±24.36,301.25±27.72,153.14±11.99,F=19.897,P=0.000;102.58±12.17,725.16±21.24,711.32±20.37,215.33±19.27,F=12.278,P=0.000).坐骨神经CCI模型组、hUCB-MSCs-Exo注射组和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠脊髓组织中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和Caspase-3蛋白表达量均高于正常对照组(坐骨神经CCI模型组:q=3.709,P=0.000;q=3.328,P=0.000;q=3.145,P=0.000;q=2.974,P=0.000;hUCB-MSCs-Exo注射组:q=2.893,P=0.019;q=2.944,P=0.013;q=3.008,P=0.009;q=3.852,P=0.000;NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组:q=2.428,P=0.022;q=4.903,P=0.000;q=3.884,P=0.000;q=4.382,P=0.000);hUCB-MSCs-Exo注射组和NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠脊髓组织中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和Caspase-3蛋白表达量均低于坐骨神经CCI模型组(hUCB-MSCs-Exo注射组:q=3.609,P=0.000;q=3.811,P=0.000;q=3.476,P=0.000;q=3.889,P=0.000;NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组:q=2.338,P=0.000;q=3.098,P=0.000;q=2.358,P=0.000;q=3.775,P=0.000);NGF-hUCB-MSCs-Exo注射组大鼠脊髓组织中NLRP3、IL-1β、Caspase-1和Caspase-3蛋白表达量均低于hUCB-MSCs-Exo注射组(q=3.798,P=0.000;q=3.573,P=0.000;q=2.998,P=0.000;q=3.208,P=0.000).结论:NGF-hUCB-MSCs-Exo治疗大鼠坐骨神经CCI,能够抑制脊髓后角灰质病变和脊髓细胞凋亡,其作用机制可能与抑制NLRP3、IL-1β、Caspase-1和Caspase-3的表达有关.