膜蛋白异源表达快速筛选方法建立

• 作者: 王炜 陈明心 陈磊 张岱 蒋露 荆鹏伟 任伟宏
• 来源期刊: 热带医学杂志
• 学科: 生物学
• 关键词: 绿色荧光蛋白 hCD81 昆虫细胞 重组表达
• 年，卷（期）: 2021,（12）
• 所属期刊栏目: 实验研究论著|Experiment Research
• 页码范围: 1523-1526,1532,封3
• 页数: 6页
• 分类号: Q95-33
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1672-3619.2021.12.006

摘要

目的 建立一种快速的膜蛋白异源表达筛选方法,并验证重组蛋白细胞内定位及完整性.方法 使用重叠PCR方法将绿色荧光蛋白(GFP)基因与人CD81 (hCD81)基因连接一起构成hCD81-GFP融合基因,重组基因克隆至pFastBac1载体上,使用昆虫细胞异源表达重组基因.通过观察绿色荧光信号判断重组蛋白的表达及定位.纯化重组蛋白,通过尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE分析重组蛋白的大小.结果 使用hCD81上游引物和GFP下游引物进行PCR扩增获得hCD81-GFP融合基因,在1000和2000 bp DNA Marker旁有一条带与融合基因hCD81-GFP大小近似.融合基因插入pFastBac1质粒后测序证明,插入的融合基因序列正确.分子排阻色谱及SDS-PAGE分析显示,hCD81与绿色荧光蛋白融合表达.荧光信号显示重组蛋白定位到细胞膜上,与hCD81分子的细胞定位一致.分子排阻色谱结果显示,重组蛋白的洗脱峰成高斯分布,提示纯化的重组蛋白分子体积均一.依据hCD81-GFP融合蛋白的洗脱体积16.859 mL计算出的重组蛋白分子量为58.34×103Mr,与重组蛋白的理论分子量56.10×103 Mr近似;洗脱液的SDS-PAGE分析显示,重组蛋白条带与66.2×103Mr蛋白Marker位置近似.结论 目标蛋白与绿色荧光蛋白连接,通过观察荧光信号,仅需少量的细胞培养即可判断重组蛋白是否表达.该方法可以加快重组蛋白的表达筛选.