Split-GFP双分子荧光互补技术在鸡MSTN基因RNAi检测中的应用

• 作者: 杨磊 朱正 王博永 梁谦学 吴文德 李恭贺 郑喜邦 广西大学动物科学技术学院
• 来源期刊: 南方农业学报
• 关键词: 肌肉生长抑制素(MSTN) RNA干涉(RNAi) shRNA 慢病毒 Split-GFP双分子荧光互补技术
• 年，卷（期）: 2024,（8）
• 所属期刊栏目: 畜牧·兽医·水产·蚕桑
• 页码范围: 256-265
• 页数: 10页
• 语种: 中文

摘要

【目的】以Split-GFP双荧光互补技术检测鸡肌肉生长抑制素基因(MSTN)RNA干涉(RNAi)效果，并与其他常用检测方法比较，以验证Split-GFP双分子荧光互补技术在RNAi效果评估中的有效性和可行性。【方法】将合成的3个shRNA慢病毒载体(shRNA-a、shRNA-b和shRNA-c)分别转染稳定表达GFP11-MSTN融合蛋白的HEK293TGFP11-MSTN细胞，经实时荧光定量PCR筛选出最佳shRNA慢病毒载体并包装为慢病毒，然后以慢病毒感染HEK293TGFP11-MSTN细胞，采用潮霉素B筛选m Cherry阳性(mCherry+)细胞，再以实时荧光定量PCR和Western blotting检测RNAi效果；得到的m Cherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒，通过荧光显微镜观察和流式细胞术评估RNAi效果。【结果】3个shRNA慢病毒载体对MSTN基因表达均有极显著的抑制作用(P<0.01，下同)，其中又以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒载体的干涉效果最佳。Anti-MSTN shRNA-a慢病毒感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞的最适MOI=3，该条件下MSTN基因相对表达量及GFP11-MSTN融合蛋白表达量均受到抑制；得到的mCherry+细胞再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒，荧光显微镜观察和流式细胞术检测结果表明，GFP+细胞数量明显减少，GFP+细胞百分率由31.1%降至11.5%。Split-GFP检测结果与实时荧光定量PCR及Western blotting检测结果相符，说明Anti-MSTN shRNA-a慢病毒能有效抑制GFP11-MSTN融合蛋白表达，发挥了RNAi作用。【结论】以Anti-MSTN shRNA-a慢病毒对MSTN基因的干涉效果最佳，其感染HEK 293TGFP11-MSTN细胞后MSTN基因表达极显著下调，且再转染pcDNA3.1(+)-GFP1-10质粒后细胞中的GFP+细胞百分率明显下降，与实时荧光定量PCR和Western blotting检测结果相符，证实Slipt-GFP双分子荧光互补技术是一种可靠的可视化RNAi检测方法。