一种简单有效的克隆未知旁侧DNA片段的方法

• 作者: 宋保亮 戚炜 李伯良
• 来源期刊: 生物化学与生物物理学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 亚克隆 筛选 步移 ACAT
• 年，卷（期）: 2002,（3）
• 所属期刊栏目: 研究简报
• 页码范围: 365-368
• 页数: 4页
• 分类号: Q7
• 语种: 英文

摘要

操作含长插入片段的DNA克隆时, 经常需要进行亚克隆和测序实验. 通常的方法首先是得到插入片段的限制性内切酶谱, 然后选择合适的内切酶消化DNA, 分离靶片段, 将其连接入质粒载体中进行下一步操作. 但这种方法工作量大, 步骤繁琐. 在此, 介绍一种不需要做限制性内切酶谱分析, 而根据靶片段的旁侧序列直接进行亚克隆实验的方法. 首先, 选择合适的限制性内切酶消化含长插入片段的DNA克隆, 其中一种酶切在已知的旁侧序列上, 另一为随机选择; 然后酶切混合物与线性化的质粒载体连接, 转化细菌得到一"亚克隆库"; 将其中的克隆挑选入96孔板培养后, 按行或列混合菌液得到相应的"pool"; 最后, 用PCR方法筛选获得含靶DNA片段的阳性克隆, 其中所用的引物一个与已知的旁侧DNA序列配对, 另一个与质粒载体上序列配对, PCR扩增已知的旁侧DNA片段以鉴定阳性克隆. 多次独立实验表明该方法简单有效, 可广泛用于亚克隆和DNA步移实验.