实时逆转录聚合酶链反应检测细胞因子表达相对定量方法的建立

• 作者: 张燕 沈茜
• 来源期刊: 中华检验医学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 聚合酶链反应 核酸扩增技术
• 年，卷（期）: 2003,（10）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 591-593
• 页数: 3页
• 分类号: R446
• 字数: 2733字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3760/j:issn:1009-9158.2003.10.005

摘要

目的建立一种实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞因子表达相对定量方法.方法以肿瘤坏死因子α(TNFα)为待测基因,以葡萄糖3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照进行检测.当靶基因和内参照基因片段克隆入载体后,进行纯化和定量及系列稀释,建立标准曲线,确定实时RT-PCR的扩增效率;同时优化反应条件,使扩增效率接近100%.然后,检测14份待检标本的TNFα和GAPDH的循环阈值(Ct).结果该法检测的最低拷贝数为103,线性范围为103～109拷贝,批内变异系数(CV)和批间CV分别为1%和8%.采用2-ΔΔCt法进行数据分析后,处理组TNFα的相对表达量比对照组高8.6～9.8倍,平均为9.2倍.结论新建立的方法敏感,重复性好,数据处理简便、可靠,适用于检测任何基因的相对表达.