人干细胞因子受体膜外区1～3免疫球蛋白样结构域的表达、纯化及活性

• 作者: 刘长征 杨克恭 梁植权 苏林 邓艳春 陈松森
• 来源期刊: 中国医学科学院学报
• 关键词: 人干细胞因子受体 免疫球蛋白样结构域 his-tag pull-down 酶联免疫结合实验
• 年，卷（期）: 2006,（2）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 154-158
• 页数: 5页
• 分类号: Q78
• 语种: 中文

摘要

目的在原核和真核细胞中表达人干细胞因子受体(c-Kit)配体结合区膜外N端1～3免疫球蛋白样结构域(c-Kit/Ig1～3),研究其配体结合活性.方法采用重叠延伸PCR定点诱变法合成c-Kit/Ig1～3双突变片段(c-Kit/Ig1～3DM),构建pET16b-c-Kit/Ig1～3DM表达质粒,转化E.coli BL21(DE3)诱导表达,稀释复性,镍柱纯化.将C端添加组氨酸标签的c-Kit/Ig1～3基因克隆入真核表达载体pEAK12中,转染HEK293 ET细胞构建c-kit/Ig1～3高效表达细胞株,从细胞培养上清中使用镍金属螯合柱收集纯化蛋白.His-tag pull-down和酶联免疫结合实验检测融合蛋白配体结合活性.结果在大肠杆菌中c-Kit/Ig1～3DM以包涵体形式表达,复性后配体结合活性很低.在HEK293 ET细胞中筛选到2个高效表达c-Kit/Ig1～3的细胞株,上清表达量为2μg/ml,融合蛋白相对分子质量为58 000;受体配体结合实验显示真核表达的c-Kit/Ig1～3有明显的干细胞因子特异结合活性,解离常数Kd值为9.39 nmol/L.结论获得了具有较高配体结合活性的c-Kit/Ig1～3融合蛋白.