抑制凋亡相关基因PNAS-2表达后 U937细胞凋亡率的改变

• 作者: 欧阳仁荣 王海嵘 钟济华 钟璐 陈芳源 韩洁英 顾春红
• 来源期刊: 诊断学理论与实践
• 学科: 医学
• 关键词: PNAS-2 细胞凋亡 短发夹RNA
• 年，卷（期）: 2007,（5）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 422-426
• 页数: 5页
• 分类号: R733.7
• 字数: 3572字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-2870.2007.05.007

摘要

目的:构建并鉴定凋亡相关基因--PNAS-2的短发夹RNA(shRNA)质粒表达载体,将其转染U937细胞,筛选后检测细胞凋亡的变化.方法:shRNA质粒载体pRNAT U6.1/NEO经限制性内切酶BamH Ⅰ及HindⅢ双酶切后,连接带有BamH Ⅰ及HindⅢ黏性末端的shRNA插入片段,转化感受态细菌,并行测序鉴定.将阳性shRNA质粒载体进行细胞转染,合并使用G418及流式细胞仪(FCM)筛选出GFP阳性细胞,应用半定量PCR鉴定shRNA封闭效果;用Annexin V-APC/7-AAD标记后,使用FCM及激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡.结果:测序鉴定证实,PNAS-2特异的shRNA质粒表达载体构建正确;合并使用G418及FCM分选出GFP阳性细胞后,半定量PCR鉴定示shRNA Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组对PNAS-2的抑制率分别为78.1%、75.4%及514%.FCM显示shRNA对照组的细胞凋亡率为(3.52±1.25)%;而shRNA Ⅰ组为(9.23±1.88)%(P＜0.01);shRNAⅡ(8.85±1.80)%(P＜0.05);shRNAⅢ组为(7.19±2.09)%(P＞0.05).激光共聚焦显微镜观察显示,shRNA对照组细胞凋亡率为7.3%;shRNA Ⅰ组为14.7%;shRNAⅡ为13.8%;shRNAⅢ为10.3%.结论:测序结果表明,本研究成功构建了PNAS-2的shRNA质粒表达载体.半定量PCR显示shRNA抑制PNAS-2表达效果佳;抑制PNAS-2后可促使细胞凋亡,提示该基因是抗细胞凋亡基因.