人canstatin腺病毒载体的构建及在卵巢癌细胞的表达

• 作者: 乔玉环 朱宝菊 李印 陈琛
• 来源期刊: 现代妇产科进展
• 学科: 医学
• 关键词: Canstatin 基因治疗 腺病毒 载体构建 卵巢肿瘤
• 年，卷（期）: 2008,（11）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 805-808
• 页数: 4页
• 分类号: R737.31
• 字数: 3238字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1004-7379.2008.11.002

摘要

目的:构建并鉴定人canstatin基因腺病毒表达载体Ad-can及研究在卵巢癌的表达.方法:(1)提取人卵巢癌组织总RNA,设计带有特殊酶切位点的引物,用RT-PCR方法扩增canstatin片段,克隆入载体pMD-18T,并转化至大肠杆菌DH5α,大量扩增目的基因(pMD-can);(2)双酶切pMD-can和pAdtrack质粒,酶切产物在T4DNA连接酶作用下连接,获得pAdtrack-canstatin(pAdtr-can)穿梭载体;(3)Pme I酶切pAdtr-can,使其线性化,并与腺病毒骨架质粒pAdeasy共同转化大肠杆菌BJ5183,使其同源重组,获得pADeasy-canstatin(pAd-can)载体;(4)内切酶Pac I再次将重组子线性化,脂质体转染细胞株HEK293,借助GFP表达观察包装病毒Ad-can.重组腺病毒载体感染HEK293细胞扩增病毒,经4次扩增、纯化后,用空斑形成实验法测病毒滴度;(5)用包装的病毒转染卵巢癌细胞H08910PM,借助GFP的荧光表达观察卵巢癌细胞转染情况;(6)RT-PCR检测转染后卵巢癌细胞中目的基因的表达.结果:各中间载体经酶切鉴定,DNA测序证实正确.转染的HEK293细胞2～3天产生病毒,7～10天出现病毒斑.最终包装的病毒中携带有目的基因canstatin,并能够在包装细胞中表达.用空斑形成实验法测定病毒滴度约为1.6×1011 pfu/ml.将包装的病毒转染卵巢癌细胞,荧光显微镜下可观察到大部分卵巢癌细胞发出绿色荧光,经RT-PCR检测可发现canstatin基因扩增片段.结论:大肠杆菌内同源重组法能有效和较方便的构建canstatin基因腺病毒载体Ad-can.重组子Ad-can能转染卵巢癌细胞,并在卵巢癌细胞中表达,为进一步研究canstatin基因治疗卵巢肿瘤提供了良好的转导载体.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	朱宝菊	郑州大学第二附属医院妇产科	18	117	6.0	10.0
2	陈琛	郑州大学第二附属医院病理科	51	159	7.0	9.0
3	李印	河南省肿瘤医院胸外科	61	342	10.0	15.0
4	乔玉环	郑州大学第一附属医院妇产科	142	898	13.0	21.0