基于蛋白质反式剪接的双载体凝血Ⅷ因子基因转移

• 作者: 刘泽隆 刘相钦 屈慧鸽 朱甫祥 迟晓艳
• 来源期刊: 中国科学C辑
• 关键词: intein 蛋白质反式剪接 凝血Ⅷ因子 双载体基因转移
• 年，卷（期）: 2009,（8）
• 所属期刊栏目: 论文
• 页码范围: 746-754
• 页数: 9页
• 语种: 中文

摘要

以intein的蛋白反式剪接为工具,研究了运用双载体的真核细胞凝血Ⅷ因子(FⅧ)基因转移,通过翻译后剪接得到完整的功能性FⅧ蛋白.将B结构域大部分缺失(A761～1639)的人功能性FⅧ(BDD-FⅧ)cDNA于剪接所需保守残基Ser1657前断裂为重链和轻链,分别与106和48个氨基酸的mini Ssp DnaB intein的N端(IntN)和C端(IntC)编码序列融合,构建一对在质粒pcDNA3.1的强启动子CMV驱动下的真核表达载体.用脂质体共转染至293细胞和COS.7细胞,培养48 h后,收集细胞上清,用ELISA检测培养上清中剪接形成的BDD-FⅧ蛋白水平,用Coatest法检测上清的功能性FⅧ生物活性,并用Western blot观察细胞内的BDD-FⅧ蛋白质剪接.结果显示,两种细胞培养上清中有较高水平的剪接BDD-FⅧ蛋白形成,分别达到(137±23)和(109±22)ng/mL,由细胞内和细胞外(培养上清)的剪接共同组成;并检测到培养上清中较高水平的FⅧ生物活性,分别为(1.05±0.16)和(0.79±0.23)IU/mL,包括细胞内、外剪接产物BDD-FⅧ共同形成;细胞总蛋白的Westernblot进一步显示共转染后细胞内高效剪接形成的BDD-FⅧ蛋白.表明intein可用于双载体系统真核细胞FⅧ基因转移,并不完全依赖细胞内的剪接产生具有高FⅧ生物活性的BDD-FⅧ蛋白,为进一步在甲型血友病基因治疗研究中应用双腺相关病毒载体(AAV)转运FⅧ基因,克服AAV载体的容量限制提供了依据.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	屈慧鸽		72	330	10.0	15.0
2	刘泽隆		49	99	7.0	9.0
3	朱甫祥		38	21	3.0	4.0
4	迟晓艳		47	54	4.0	6.0
5	刘相钦		1	0	0.0	0.0