抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的制备及单链抗体基因的构建

• 作者: 戴素明 李娜 胡春华 谢玉明 邓子牛 马先锋 龙桂友
• 来源期刊: 中国农业科学
• 学科: 农学
• 关键词: 柑橘溃疡病 单克隆抗体 单链抗体 pthA基因
• 年，卷（期）: 2009,（3）
• 所属期刊栏目: 植物保护
• 页码范围: 884-890
• 页数: 7页
• 分类号: S4
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2009.03.016

摘要

[目的]制备抗Pthh-NLS多肽单克隆抗体并构建其单链抗体(single chain variable fragment,ScFv)基因,为从PthA角度进一步研究柑橘溃疡病致病机理创造条件,并为构建单链抗体基因植物表达载体,尝试利用转基因和植物抗体技术创制抗溃疡病柑橘新种质奠定基础.[方法]利用PthA-NLS重组多肽免疫Balb/c小鼠,制备抗PthA-NLS多肽单克隆抗体,从分泌抗PthA-NLS多肽单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA,采用RT-PCR和重叠延伸PCR(splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)法构建其单链抗体基因,并克隆到pGEM-T载体和原核表达载体pET32a(+)中,重组原核表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后诱导重组蛋白的表达.[结果]获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株1C8H1,2D1286、3DSA10.成功构建了单链抗体基因ScFv,获得的ScFv基因大小约750 bp,其中重链可变区(VH)基因有360 bp,轻链可变区(VL)基因有342 bp,中间连接肽基因45 bp,经过IPTG诱导ScFv原核表达,获得了大小为44.5 kD的ScFv重组蛋白.[结论]试验获得了3株能稳定分泌抗PthA-NLS多肽的单克隆抗体杂交瘤细胞株,成功构建了ScFv基因,并实现了原核表达,为进一步探索PthA的致病机理和下一步利用抗体技术获得抗溃疡病柑橘种质的研究打下了基础.