基于狂犬病病毒G蛋白scFv介导的靶向shRNA制备与鉴定

• 作者: 单虎 夏咸柱 崔燕 杨松涛 杨瑞梅 王化磊 王承宇
• 来源期刊: 微生物学报
• 学科: 生物学
• 关键词: 狂犬病毒 单链抗体 绿脓杆菌外毒素跨膜区 基因运送 shRNA
• 年，卷（期）: 2010,（2）
• 所属期刊栏目: 侵染和免疫
• 页码范围: 256-262
• 页数: 7页
• 分类号: Q78
• 语种: 中文

摘要

[目的]探讨以狂犬病病毒G糖蛋白单链抗体介导的载体表达shRNA靶向制剂,靶向抑制狂犬病毒复制的可行性.[方法]应用PCR技术获得狂犬病毒G糖蛋白单链抗体scFv(G)和绿脓杆菌跨膜区-酵母DNA结合结构域ETA-GAL4基因,通过搭桥PCR法获得scFv(G)一ETA-GAL4(SEG)嵌合基因;克隆至原核表达载体pET28a(+),构建重组表达质粒pET28a(+)-scFv(G)-ETA-GAL4(pET28a-SEG);在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,利用镍柱亲和层析法纯化包涵体,经复性、鉴定制得SEG蛋白;ELISA法检测表达蛋白与狂犬病毒特异结合活性;将SEG蛋白与含shRNA的质粒(pRNATU6.3-shRNA)连接制成靶向shRNA,接入100 TCID50狂犬病毒感染BHK-21细胞,35 h观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达情况;48 h用直接免疫荧光抗体试验测定复合物抑制病毒效果.[结果]克隆得到1557 bp的SEG蛋白编码基因,大肠杆菌中成功表达57 KDa的SEG蛋白,能与抗His的单克隆抗体发生特异性反应,SEG蛋白经镍柱纯化、复性后得率为2.8 mg/mL.ELISA试验证明SEG蛋白在一定浓度范围内与RV结合呈正相关.细胞试验表明GFP在细胞内得到表达;直接免疫荧光试验测定该复合物能抑制76%病毒复制.[结论]SEG蛋白能与携带shRNA的质粒结合,可运送该质粒至RV感染BHK-21细胞中,抑制狂犬病毒的复制.