人periostin干扰载体的构建及其对成纤维细胞目的基因表达的影响

• 作者: 刘畅 宋振华 秦泽莲
• 来源期刊: 北京大学学报医学版
• 关键词: periostin 成纤维细胞 RNA干扰 瘢痕疙瘩 慢病毒属
• 年，卷（期）: 2010,（5）
• 页码范围: 503-508
• 分类号: R34
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1671-167X.2010.05.003

摘要

目的:为了研究人成骨细胞特异因子-2(periostin,POSTN)基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的影响,构建shRNA质粒和慢病毒载体,观察其对293T细胞和瘢痕疙瘩成纤维细胞的POSNT基因表达的抑制作用,检测shRNA慢病毒载体对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响.方法:设计特异性干扰人POSTN基因的小发卡RNA序列,合成含有干扰序列的双链DNA oligo,与经双酶切后的质粒连接,转化感受态大肠杆菌DH5α并对阳性克隆进行PCR扩增测序鉴定.将构建的质粒采用脂质体共转染入293T细胞,36～48 h后采用Western blot的方法检测目的蛋白的表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果.将干扰效果最好的序列包装shRNA质粒和慢病毒载体,利用生成的POSTN shRNA质粒和慢病毒分别感染293T细胞和原代瘢痕疙瘩成纤维细胞,检测两种细胞目的基因、蛋白的表达,进而观察基因干扰后瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖变化.结果:转染干扰质粒原代瘢痕疙瘩成纤维细胞、感染空质粒阴性对照细胞和正常皮肤成纤维细胞的POSTN mRNA表达分别为1.98±0.03、1.12±0.03和1.08±0.03,实验组对比阴性对照组细胞的敲减率为43%(F=688.291,P<0.001).感染干扰慢病毒原代瘢痕疙瘩成纤维细胞、感染空病毒阴性对照细胞和正常皮肤成纤维细胞的POSTN mRNA表达分别为0.44±0.09、0.81±0.07和0.37±0.05,实验组对比阴性对照组细胞的敲减率为46%(F=90.06,P<0.001).实验组POSTN蛋白表达水平(0.29±0.04)比阴性对照组细胞(0.53±0.09)的表达降低45%(F=33.43,P<0.001),正常皮肤成纤维细胞POSTN蛋白的表达水平为0.23±0.02.感染干扰质粒和慢病毒的原代瘢痕疙瘩成纤维细胞与空质粒转染的对照细胞相比,POSTN蛋白和mRNA的表达水平亦明显降低,并趋近正常皮肤成纤维细胞的表达.从感染慢病毒48 h开始,干扰组瘢痕疙瘩成纤维细胞与空质粒转染的对照组细胞相比增殖明显减慢,抑制率达19%.结论:本方法构建的POSTN基因干扰质粒和慢病毒构建成功,其能显著降低POSTN基因和蛋白在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达,干扰POSTN基因表达抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖.POSTN基因干扰质粒和慢病毒的构建成功为进一步研究POSTN基因的功能奠定了研究基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	秦泽莲	北京大学第三医院成形外科	34	187	8.0	11.0
2	刘畅	北京大学第三医院成形外科	135	720	12.0	23.0
3	宋振华	北京大学第三医院成形外科	2	17	2.0	2.0