L303E/F309S突变促进细胞分泌内含肽连接的B区缺失型凝血Ⅷ因子

• 作者: 刘泽隆 屈慧鸽 朱甫祥 杨树德 缪静 迟晓艳
• 来源期刊: 中国细胞生物学学报
• 关键词: B区缺失型FⅧ 突变重链 分泌 内含肽 蛋白质剪接
• 年，卷（期）: 2010,（4）
• 所属期刊栏目: 研究论文
• 页码范围: 575-582
• 页数: 8页
• 语种: 中文

摘要

凝血Ⅷ因子(FⅧ)尽管与凝血V因子具有相似的结构,但其分泌的低效性不仅限制了重组产品在甲型血友病患者中的广泛应用,也困扰基于转FⅧ基因的基因治疗.为了提高FⅧ的分泌效率,在我们以前用内含肽(intein)的蛋白质剪接功能介导的双载体转B区缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)基因研究的基础上,探讨了重链L303E/F309S双突变对剪接BDD-FⅧ蛋白分泌的影响.PCR突变法将L303E/F309S双突变引入我们以前构建的融合Ssp DnaB内含肽的野生型重链(HCIntN),得到融合内含肽的重链突变基因(DMHCIntN),与融合内含肽的轻链(IntCLC)基因共转染培养的293细胞,用ELISA检测了培养上清中的重链多肽和剪接的BDD-FⅧ蛋白浓度,用Coatest法分析了培养上清的凝血生物活性.结果显示,单独转DMHCIntN和DMHCIntN与IntCLC共转染细胞上清中的分泌的重链多肽浓度分别为(35±12)ng/ml和(178±19)ng/ml,高于单独转HCIntN细胞和HCIntN与IntCLC共转细胞[(14±6)ng/ml和(127±23)ng/ml];共转DMHCIntN和IntCLC细胞上清中剪接的BDD-FⅧ蛋白浓度和活性分别为(128±24)ng/ml和(1.01±0.15)U/ml,明显高于共转HCintN和IntCLC细胞[(90±12)ng/ml和(0.71±0.14)U/ml];另外,单独转DMHCIntN和IntCLC的细胞合并培养后的上清也检测到剪接的BDD-FⅧ蛋白[(20±3)ng/ml]和活性[(0.17±0.07)U/ml].结果表明,双突变可提高重链的分泌效率并明显被轻链顺式提高,伴之以剪接BDD-FⅧ的分泌增加,表明内含肽对双载体转BDD-FⅧ基因功效的改善并表现出不依赖细胞机制的BDD-FⅧ剪接作用.为进一步动物体内实验运用内含肽的双AAV转重链双突变BDD-FⅧ基因研究奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	屈慧鸽		72	330	10.0	15.0
2	刘泽隆		49	99	7.0	9.0
3	缪静		57	250	10.0	14.0
4	朱甫祥		38	21	3.0	4.0
5	迟晓艳		47	54	4.0	6.0
6	杨树德		27	167	6.0	12.0