人过氧化氢酶基因重组腺病毒的构建及其酶活性的测定

• 作者: 宁启兰 李爱玲 杨旭东 欧阳晓玲 王慧莲 许楠
• 来源期刊: 浙江大学学报（医学版）
• 学科: 生物学
• 关键词: 过氧化氢酶/遗传学 腺病毒科/遗传学 基因 重组,遗传 遗传载体 转染 基因疗法 质粒 肾/胚胎学 肾/细胞学
• 年，卷（期）: 2011,（3）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 291-296
• 分类号: Q782
• 字数: 4166字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3785/j.issn.1008-9292.2011.03.011

摘要

目的:构建含人过氧化氢酶(catalase,CAT)基因的重组腺病毒载体,为基因治疗提供一种新的方法.方法:从人血中分离白细胞,提取总RNA,利用RT-PCR法获得人CAT的全长cDNA,克隆到pcDNA3.1+中,构建pcDNA3.1+-CAT载体,酶切和基因测序鉴定阳性克隆;利用酶切法把CAT基因克隆至入门载体pENTRI A中,构建pENTRI A-CAT载体;利用LR反应,体外重组pENTRIA-CAT和pAd/CMV/Vs-DEST,得重组腺病毒表达载体pAd/CMV/V5-DEST-CAT.经测序鉴定,并用Pac I线性化pAd/CMV/V5-DEST-CAT后,与脂质体2 000共转染293A细胞,重组病毒颗粒的包装、扩增和滴度测定.利用免疫印迹和240 am紫外光吸收法测定重组病毒中CAT蛋白的表达量和CAT的活性.结果:Ad-CAT、(A组)Ad-LacZ(B组)及PBS(C组)感染293A细胞24h,其细胞蛋白提取液在1至4 min反应中CAT活性的变化经单因素方差分析,三组间差异有统计学意义(F=5.96,P<0.05).其中,A组4 min内的酶活性分别比B组和C组高出(63.8±1.54)%和(76.7±1.67)%(P<0.05),而B组与C组比差异无统计学意义(P>0.05).结论:本研究成功构建了含人CAT基因的Ad/CMV/V5-DEST.CAT载体,并在293A细胞中包装出高表达及高活性重组腺病毒,为进一步研究人CAT基因在基因治疗中的作用奠定了基础.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	宁启兰	西安交通大学医学院遗传与分子生物学系	23	81	5.0	8.0
2	李爱玲	西安交通大学医学院遗传与分子生物学系	17	40	4.0	5.0
4	杨旭东	西安交通大学医学院遗传与分子生物学系	21	120	6.0	10.0
5	许楠	西安交通大学医学院遗传与分子生物学系	8	17	2.0	3.0
6	欧阳晓玲	西安交通大学医学院遗传与分子生物学系	1	1	1.0	1.0