在Sf9昆虫细胞-杆状病毒系统中表达毒蕈碱型M2及M5受体重组突变体

• 作者: 孙洪良 牟男 王丽韫 郑建全
• 来源期刊: 中国药理学与毒理学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 乙酰胆碱 毒蕈碱受体 昆虫细胞 杆状病毒 基因克隆 基因表达
• 年，卷（期）: 2011,（3）
• 所属期刊栏目: 实验方法
• 页码范围: 320-326
• 分类号: R966|Q78
• 字数: 5281字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3867/j.issn.1000-3002.2011.03.020

摘要

目的 为乙酰胆碱毒蕈碱(M)受体亚型特异性的变构调节剂及基因工程的研究提供实验平台.方法 用PCR及搭桥PCR法对乙酰胆碱M2及M5受体作以下突变:①将N-糖基化位点Asp突变为Asn;②删除对蛋白酶敏感的M受体的第三个细胞内环;③在C端添加凝血酶识别位点(CMV)和6-His标记.将PCR扩增出重组嵌合蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞表达M2/M5受体蛋白.Western印迹及放射性配体受体结合实验验证受体的正确表达及功能.结果 通过搭桥PCR,成功扩增出1018 bp的重组M2受体和1041 bp重组M5受体核酸序列;使用pUC/M13的扩增引物成功构建M2/M5重组转移载体.将重组载体质粒与线性化病毒DNA共转染昆虫细胞Sf9,制备重组杆状病毒并感染昆虫细胞,见细胞空泡样病变.Western印迹分析确定重组杆状病毒感染昆虫细胞M2/M5蛋白表达,放射性配体受体饱和实验结果表明,表达的重组受体蛋白与[3H]N-甲基-东莨菪碱具有特异性结合能力.结论 Sf9昆虫细胞能够表达M2及M5重组受体蛋白,M2及M5重组受体蛋白的病毒样颗粒可用于M受体的新药研究.

作者信息

序号	姓名	单位	发文数	被引次数	H指数	G指数
1	牟男	军事医学科学院毒物药物研究所军事毒理及生化药理室	4	15	2.0	3.0
2	孙洪良	军事医学科学院毒物药物研究所军事毒理及生化药理室	8	13	2.0	3.0
3	郑建全	军事医学科学院毒物药物研究所军事毒理及生化药理室	78	220	7.0	10.0
4	王丽韫	军事医学科学院毒物药物研究所军事毒理及生化药理室	8	24	3.0	4.0