荧光定量PCR用于按蚊体内疟原虫子孢子检测的研究

• 作者: 刘耀宝 周华云 曹俊 朱国鼎 朱韩武 李菊林 汪圣强 王伟明 顾亚萍 高琪
• 来源期刊: 中国血吸虫病防治杂志
• 学科: 医学
• 关键词: 荧光定量PCR 按蚊 疟原虫子孢子 虫种鉴别
• 年，卷（期）: 2012,（4）
• 所属期刊栏目: 论著
• 页码范围: 445-449
• 分类号: R382.31
• 字数: 4153字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1005-6661.2012.04.020

摘要

目的 建立一种用于按蚊体内疟原虫子孢子定量检测和虫种鉴别的荧光定量PCR方法.方法 采用针对4种人体疟原虫18S rRNA基因属特异性保守区的1对引物,以疟原虫18S rRNA基因重组质粒与按蚊DNA的混合物为模板,进行反应体系和反应条件优化,验证方法的特异性,并通过熔解曲线分析进行虫种鉴别.应用阴性按蚊DNA稀释的间日疟原虫18S rRNA基因重组质粒为模板制作标准曲线,并分别以质粒DNA和实验室子孢子感染阳性的按蚊DNA为模板分析建立的荧光定量PCR方法的敏感性.在反应体系中加入不同部位、不同用量按蚊DNA,以探讨按蚊DNA对检测效果的影响.结果 该方法对按蚊、人血DNA均无扩增,对4种疟原虫DNA均有特异性扩增且扩增产物的熔解温度(Tm)易于区分,三日疟原虫、恶性疟原虫、卵形疟原虫和间日疟原虫的Tm值分别为71.0、72.7、73.9℃和75.9℃.标准曲线中循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的相关性(相关系数r=-0.99).最低可以检出含50拷贝的质粒DNA或32倍稀释的子孢子阳性按蚊DNA样本.按蚊DNA对荧光定量PCR反应具有抑制作用.荧光定量PCR的Ct值在实验内和实验间均具有良好的重现性.结论 新建立的SYBR Green Ⅰ染料荧光定量PCR方法具有较高的敏感性和特异性,可用于按蚊体内疟原虫子孢子的检测,并可同时对4种人体疟原虫进行鉴别.