细粒棘球绦虫Hsp70基因的克隆、表达及抗体制备

• 作者: 古努尔·吐尔逊 张壮志 张文宝 张旭 石保新 米晓云 薛晶 赵莉 金映红 陈皓斐 马正海
• 来源期刊: 中国农业科学
• 学科: 农学
• 关键词: 细粒棘球绦虫 热休克蛋白家族基因Hsp70 抗血清
• 年，卷（期）: 2012,（12）
• 所属期刊栏目: 兽医
• 页码范围: 2491-2501
• 分类号: S852.7
• 语种: 中文
• DOI: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.12.019

摘要

[目的]克隆细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)热休克蛋白家族基因Hsp70,在原核细胞中表达、纯化Hsp70蛋白并制备其特异性抗体.[方法]从包囊中分离原头蚴,提取RNA,RT-PCR扩增EgHsp70基因的cDNA,将其构建至原核表达载体pMAL-p2x,转化大肠杆菌BL-21菌株.通过改变诱导温度、IPTG浓度和诱导时间筛选出EgHsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件.并用麦芽糖亲和层析法纯化该蛋白.纯化蛋白经皮下多点注射免疫新西兰白兔制备抗血清,ELISA和Western blotting检测血清效价和特异性.[结果]RT-PCR扩增获得EgHsp70基因的cDNA,酶切和测序结果表明EgHsp70基因已克隆入pMAL-p2x.表达条件优化实验结果筛选出Hsp70融合蛋白可溶性表达的最佳条件为:当A600为0.6时,以0.3mmol·L-1 IPTG于30℃条件下诱导表达4h.SDS-PAGE显示Hsp70融合蛋白相对分子质量约为68.6kD,经麦芽糖亲和层析法纯化获得了Hsp70融合蛋白,其表达量为2.5 mg·L-1.Western blotting检测证明制备的抗血清与EgHsp70融合蛋白、原头蚴粗提抗原、E.granulosis虫体蛋白和E.granulosis虫体表面蛋白均能特异性结合,ELISA检测表明获得的抗血清效价达到1∶256000.[结论]在大肠杆菌中表达并纯化获得了EgHsp70融合蛋白,并制备了高效价的兔抗EgHsp70蛋白抗血清,为研制包虫病疫苗及相关诊断试剂奠定了基础.