组织蛋白酶B过表达质粒和特异性siRNA表达质粒的构建与转染及对血管平滑肌细胞作用初步探讨

• 作者: 冯健 尤华彦 张涛 李坚 王强 羊镇宇 薄小萍 郭素峡 陈茂华
• 来源期刊: 南京大学学报：自然科学版
• 学科: 生物学
• 关键词: 组织蛋白酶B 血管平滑肌细胞 小分子RNA干扰 细胞凋亡
• 年，卷（期）: 2012,（6）
• 页码范围: 809-816
• 分类号: Q463
• 语种: 中文

摘要

构建并转染pcDNA3．1-cathepsinB和pSilencer2．1cathepsinB质粒，建立组织蛋白酶B过表达细胞株与基因沉默细胞株，初步探讨组织蛋白酶B对血管平滑肌细胞凋亡的作用．通过RTPCR法扩增获得组织蛋白酶B全基因序列并构建pcDNA3．1cathepsinB表达质粒，同时设计针对组织蛋白酶B靶序列的siRNA，按shRNA表达质粒的克隆策略，设计针对该序列的双链DNA序列并构建pSilencer2．1-cathepsinB质粒，通过脂质体转染人主动脉平滑肌细胞（HA—VsMC），经过筛选鉴定建立组织蛋白酶B过表达株与基因沉默株．通过TNF—α／actD（放线菌素D）诱导细胞凋亡，从细胞活性分析、流式细胞术观察组织蛋白酶B对血管平滑肌细胞的作用，并加入组织蛋白酶抑制剂（E64d）和组织蛋白酶B特异性抑制剂（CA-074ME），观察细胞活性改变．实验结果表明转染pcDNA3．1cathepsinB细胞组织蛋白酶B蛋白水平明显高于对照组，而转染pSiiencer2．1-cathepsinB细胞组织蛋白酶B蛋白水平明显低于对照组．噻唑蓝分析经TNF-α／actD诱导后细胞活性明显降低，与对照组（14．60％±1．34％）比较，沉默组（21．30％±2．37％）活性增加，而过表达组（9．98％±1．04％）较对照组明显下降，加入E64d、CA-074ME组（18．23％±1．05％，17．40％±1．13％）较过表达组活性增加，流式细胞术定量检测得到相似结果．表明组织蛋白酶B对TNF-α／actD诱导的血管平滑肌细胞凋亡具有促进作用．