HMGB1调控区Jurkat稳定细胞株的构建

• 作者: 孔海瑞 尹明梅 张晨光 时慧森 牛志国 王辉 王雪平 胡丽华 胡亚会 郑融融 陈仪
• 来源期刊: 中国免疫学杂志
• 学科: 医学
• 关键词: HMGB1调控基因 Jurkat细胞 报告基因 稳定转染
• 年，卷（期）: 2012,（10）
• 所属期刊栏目: 免疫学技术与方法
• 页码范围: 926-929
• 分类号: R392
• 字数: 2761字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1000-484X.2012.10.014

摘要

目的:构建不同长度的高迁移率族蛋白1 (HMGB1) 基因调控序列的真核表达载体及其稳定表达的Jurkat细胞株,为研究HMGB1基因在白血病发病机制建立基础.方法:以Jurkat细胞基因组为模板,PCR扩增3′端固定的8个不同长度的HMGB1调控基因(-83 bp～+83 bp、-383 bp～+83 bp、-504 bp～+83 bp、-688 bp～+83 bp、-975 bp～+83 bp、-1 163 bp～+83 bp、-1 327 bp～+83 bp、-1 520 bp～+83 bp),均将其连入pMD18-T载体,并转化大肠杆菌DH5a.对氨苄青霉素筛选的阳性克隆进行扩增、质粒抽提,应用KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切鉴定和DNA测序获得序列正确的阳性克隆,然后再经酶切连入pGL3-neo-luc质粒,成功构建HMGB1基因调控序列报告基因pGL3-HMGB1-luc(按由短至长顺序依次命名为1～8号质粒).利用脂质体介导的方法将不同长度的pGL3-HMGB1-luc质粒和pGL3-neo-luc质粒分别转染至Jurkat细胞,48小时后加入终浓度600 μg/ml的G418进行药物加压筛选,20天后得到有效转染pGL3-HMGB1-luc及pGL3-neo-luc载体的Jurkat细胞株(按有无HMGB1调控基因及其由短至长顺序,依次命名为NEO细胞和1~8号细胞).通过检测荧光素酶活性,验证构建的Jurkat稳定细胞株(Jurkat-HMGB1).结果:HMGB1调控基因成功插入到pGL3-neo-luc的XhoⅠ和HindⅢ位点之间构建出3号质粒;HMGB1调控序列1016 bp定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和XhoⅠ位点之间,成功构建出8号质粒;将166、466、771、1 058、1 246、1 410 bp长度的HMGB1调控基因定向克隆至3号质粒的KpnⅠ和HindⅢ位点之间,分别构建出1号、2号、4号、5号、6号、7号质粒.8个质粒均经KpnⅠ/HindⅢ、BamHⅠ/HindⅢ双酶切,电泳显示条带与扩增的HMGB1调控序列长度一致.HMGB1-T载体的DNA测序结果与NCBI提供序列完全匹配.成功构建了不同长度的3′端固定的pGL3-HMGB1-luc报告基因.pGL3-neo-luc和pGL3-HMGB1-luc稳定转染至Jurkat细胞后,成功构建了NEO细胞和稳定细胞株HJ1~8,其荧光素酶发光值分别为:123、151 288、136 057、110 623、100 874、214 523、147 597、161 348、145 490.结论:构建的HMGB1调控序列报告基因和HJ稳定细胞株为找寻有意义的HMGB1调控区域,以及后期研究HMGB1基因在成人T淋巴细胞白血病中的发病机制奠定了基础.