绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)丙酮酸脱氢酶E1-α亚单位基因(pdha)的克隆、表达及其免疫学活性测定

• 作者: 储岳峰 剡根强 许健 贺英 赵萍 逯忠新 高鹏程
• 来源期刊: 农业生物技术学报
• 学科: 农学
• 关键词: 绵羊肺炎支原体 pdha基因克隆 PDHA蛋白表达 免疫学活性
• 年，卷（期）: 2012,（3）
• 所属期刊栏目: 研究报告
• 页码范围: 275-282
• 分类号: S858.26
• 字数: 4923字
• 语种: 中文
• DOI: 10.3969/j.issn.1674-7968.2012.03.007

摘要

丙酮酸脱氢酶α-亚单位(PDHA)在病原体丙酮酸脱氢酶的催化过程中发挥着重要作用.为表达绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)PDHA蛋白并测定其免疫学活性,应用PCR方法扩增出绵羊肺炎支原体pdha基因并对其序列进行分析,将pdha基因中色氨酸密码子TGA优化为TGG后进行全基因合成,插入到pET32-a(+)载体上,构建了pET3 2-a(+ )-pdha重组质粒,将重组质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中诱导表达PDHA蛋白,并通过免疫印迹及小鼠(Mus musculus)免疫试验对其免疫学活性进行测定.结果pdha基因全长1 125 bp,编码375 aa,(G+C)％为34.76％,第304～306位、379～381位、586～588位、592～594位、625～627位、811～813位、889～891位及964～966位TGA在支原体中编码色氨酸而不是作为终止密码子；基因序列比对及进化树分析显示,绵羊肺炎支原体pdha基因与10种支原体的pdha基因序列同源性为32.6％～85.3％,氨基酸序列同源性为39.3％～90.6％,基因序列和氨基酸序列均与猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)有同源性,分别为85.3％和90.6％；绵羊肺炎支原体pdha基因在33℃、IPTG 0.25 mmol/L诱导6h的表达条件下,表达量最高；重组的PDHA蛋白可与绵羊肺炎支原体高免血清具有免疫印迹条带,在免疫小鼠后血清抗体效价与对照组相比,均显著升高(P＜0.05).本实验首次成功克隆表达了绵羊肺炎支原体pdha基因,并证明其重组PDHA蛋白具有较好的免疫学活性.为绵羊支原体肺炎基因工程疫苗及诊断研究提供候选靶标.